水产品中氯霉素的测定

1.目的
使氯霉素的测定处于受控状态，保证氯霉素检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目 检测工作人员的操作规程。
2.适用范围
适用于水产品中氯霉素残留量的筛选检验。
3.引用标准
《动物源食品中氯霉素残留检测 酶联免疫吸附法》农业部 1025 号公告-26-2008 《氯霉素酶联免疫检测试剂盒说明书》 广州瑞森生物科技有限公司 《无公害食品 水发水产品》 NY 5172-2002 《分析实验室用水规格和试验方法》GB/T 6682-2008 《食品卫生检验方法 理化部分 总则》 GB/T5009.1-2003
5.5.酶联免疫测定
5.5.1.将标准品对应微孔按序编号后分别分别加入 100μ L 氯霉素标准溶液。 5.5.2.在其他的微孔加入 100μ L 已完成前处理的样品溶液。 5.5.3.再于每一微孔另加入 50μ L 已完全回温的酶标记物。 5.5.4.轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置 1 小时。 5.5.5.将微孔中的反应液甩掉，再将已稀释清洗液加满每一微孔后甩掉，重复 3 次。 5.5.6.最后一次甩掉清洗液后，在吸水纸上拍干。 5.5.7.于每一微孔加入显色液 100μ L 后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。 5.5.8.于室温下避光静置 20 分钟。 5.5.9.加入反应终止液，每一微孔加入 100μ L。 5.5.10.酶标仪以单波长 450nm 或双波长 450nm/650nm 读值。
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5.2.仪器
5.2.1.酶标仪(配备 450nm 滤光片)。 5.2.2.旋转蒸发仪。 5.2.3.匀浆器。 5.2.4.振荡器。 5.2.5.冷冻离心机。 5.2.6.微量移液器:单道 20μ L、50μ L、100μ L、1000μ L；多道 250μ L。 5.2.7.天平:感量 0.01g。 5.2.8.氮气吹干装置。
6.检测方法灵敏度、准确度、精密度
6.1.灵敏度
本方法在鱼、虾、蟹样品中氯霉素的检出限为 0.025ppb。
6.2.准确度
本方法的回收率为 70％～130％。
6.3.精密度
本方法样本的变异系数小于 10％。
7.相关文件
氯霉素酶联免疫检测试剂盒说明书（广州瑞森生物科技有限公司） 酶标仪操作规程 旋转蒸发仪操作规程 匀浆器操作规程 振荡器操作规程 冷冻离心机操作规程 氮吹仪操作规程 天平称量操作规程。
5.4.样本处理
a) 将 3 克已均质的样品放入 15mL 离心管中，再加入 6mL 乙酸乙酯，震荡 5 分钟。 b) 用离心机离心 1700×g10 分钟，取 2mL 上层液(乙酸乙酯)至 10mL 玻璃管中，于 50℃下，利 用氮气将有机溶剂吹干。 c) 在此玻璃管中加入正己烷 1mL，先将残余物完全溶解后，再加入 1mL 样品稀释液，震荡 30 秒钟。 d) 用离心机离心 1700×g 10 分钟，利用吸管吸去包含中问乳化层部分的上层液(正己烷)，再 吸取下层液(水层)备用。 稀释倍数:1 若待测物为白虾可按以下流程将样品做 8 倍浓缩以增加检品敏感度 a) 将 6 克已均质的样品放入 15mL 离心管中，再加入 6mL 乙酸乙酯，震荡 5 分钟。 b) 用离心机离心 1700×g 10 分钟，取 4mL 上层液(乙酸乙酯)至 10mL 玻璃管中，于 50℃下，利 用氮气将有机溶剂吹干。 c) 在此玻璃管中加入正己烷 2mL，先将残余物完全溶解后，再加入 0.5mL 样品稀释液，震荡 30 秒钟。 d) 用离心机离心 1700×g 10 分钟，利用吸管吸去包含中问乳化层部分的上层液(正己烷)，再 吸取下层液(水层)备用。 稀释倍数:0.125
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8.注意事项
1) 使用前请先将试剂盒回温至室温(置于室温 60 分钟以上)，各溶液皆摇匀后方可使用。 2) 回温后，取出所需酶标板条，将剩余未测的 ELISA 孔条立即放回铝箔袋中，置于 4℃保存。 3) 10 倍样品稀释液与 10 倍清洗液请用蒸馏水稀释 10 倍方可使用。(如 1mL 浓缩稀释液加 9mL 蒸馏水)稀释后的 1×萃取稀释液和 1×清洗液可于 4℃保存一周。 4) 萃取流程请使用 P.P.材质的 15mL 离心管以免腐蚀。 5) 反应终止液含 0.5 N HCl，请小心操作。 6) 氯霉素标准溶液含氯霉索，请小心操作。 7) 本试剂盒的所有试剂出厂前均做过完整的测试，请使用试剂盒提供的药品及试剂，勿任意更 换。 8) ELISA 所得的氯霉索浓度若低于该样品检品敏感度即可视为该样品背景值，无须回乘稀释倍 数。反之若所得的氯霉索浓度若高于该样品检品敏感度，即可能为氯霉索阳性样品，建议使 用其它检测方法检测，如 GC/MS 等。
5.测定
5.1.原理
氯霉素酶联免疫检测试剂盒，主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进 行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中的氯霉素与微孔中的抗体进行竞争反应。在整个反 应当中，如果样品中的氯霉素残留的越多，相对地就会竞争反应越多的酶标记物，使得能结合上 抗体的酶标记物相对地减少，用 TMB 底物显色，样品中的氯霉素含量与样品的吸光度值呈反比， 与标准曲线比较即可得出氯霉素含量。
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5.6.结果判定
5.6.1.定性判定 用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含氯霉素浓度范围(ng/ml)。 假设样品 1 的吸光度值为 0.313， 样品 2 的吸光度值为 1.032， 标准液吸光度值分别是:0ppb 为 1.892； 0.025ppb 为 1.501；0.05ppb 为 1.175；0.1ppb 为 0.751；0.3ppb 为 0.421；0.6ppb 为 0.198。则样品 1 的浓度范围 0.3ppb-0.6ppb;样品 2 的浓度范围 0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数) 5.6.2.定量判定 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0 标准)的吸光度 值(BO)再乘以 100%，即百分吸光度值。 B 百分吸光度值 % = × 100% B0 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。 BO—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值。 以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准 曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对 应的稀释倍数即为样本中氯霉素的实际浓度。 若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
4.概述
氯霉素属广谱抗生素，曾在畜牧业中广为应用。但氯霉素有较强的副作用和毒性作用，如果 氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，长期微量摄入氯霉素，不仅使人体肠道正常 菌群失调，而且还会引起多种疾病，对人类的健康造成危害。世界上许多国家禁止此药用于生产 食品动物，并规定了在畜产品中氯霉素不得检出。
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5.3.试剂和材料
以下所有试剂，均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 5.3.1.乙酸乙酯。 5.3.2.乙腈。 5.3.3.正己烷。 5.3.4.0.5N 盐酸溶液 5.3.5.0.5N 氢氧化钠溶液 5.3.6.氯霉素酶联免疫试剂盒:2℃～8℃冰箱中保存。