同时测定食品中氯霉素类药物的残留量

氯霉素类药物质量条件参数详见表 2。
表2 通道
CAP 定量离子 CAP 定性离子 d5-CAP 定量离子 d5-CAP 定性离子 TAP 定量离子 TAP 定性离子 FF 定量离子 FF 定性离子
母离子 320.9 320.9 325.9 325.9 353.8 353.8 356.0 356.0
现代医学证明氯霉素（图 1-a）会抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血。约 1/3000 的人对氯霉素过敏，从而引起贫血症状，此症状的出现与否与剂量无关，所以很多国家禁止 将氯霉素使用在食用性动物上。但因其价格便宜，抗菌谱广，仍被少数厂家违规使用。氯霉 素在食品中的残留已经引起世界各国的高度重视，欧盟规定在食品中氯霉素零允许量，即不 得检出。现考虑到检测方法的检测限等因素，暂定氯霉素在食物中的含量不得大于 0.3 µg/kg， 随着检测方法的完善，该限量有可能进一步降低。
Chen Qi Xu Xiaomin Cai Zengxuan Ren Yiping Zhejiang Provincial Center for Disease Prevention and Control，Hangzhou 310009
Abstract A HPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of chloramphenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol ) in foods. Isotope dilution method was used for the quantification. For clean-up and concentration solid phase extraction (SPE) with OASIS HLB cartridges were used. The analytical method in the present study was well validated and good results were obtained with respect to precision, repeatability and spiked recovery. The limit of quantification (LOQ) were 0.02, 0.2, 0.1 ng/ml for chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol respectively. The linear range was from 0.1 to 10 µg/kg with correlation coefficients (r ) above 0.99. The mean recoveries for chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol were 101.3%, 101.1%, 102.2%, respectively. The RSD were 2.5%, 16.6%,4.8%, respectively. This method can be applied for the determination of chloramphenicols in honey, fish, shrimp and other foods.
1.2 储备液的配制： 称取将 CAP、d5-CAP、TAP、FF 标准品各 100 mg，用 100 mL 甲醇溶解，制成 1 mg/mL
储备液，保存在 4℃冰箱中。同时配制浓度分别为 10、8、6、4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、 0.1ng/mL 的标准系列，绘制标准曲线。
1.3来自百度文库仪器
质量分析器：分析器 1 低端分辨率 LF Lens1:12.0V；高端分辨率 HM Lens1：12.0V；入 口透镜电压（Entrance）：10V；碰撞电压（Collision）：12.0-18.0eV；碰撞梯度：1.6；出口 电压（Exit）：12V；分析器 2 低端分辨率 LF Lens2: 12.0V；高端分辨率 HM Lens2:12.0V；
将禽肉类样品去骨去皮，用绞肉机绞碎后，放入 0℃以下环境中储藏。 1.6.2 液体样品前处理方法
称取液体样品 1g（精确到 0.01g）样品于 10 mL 带盖的玻璃试管中，添加 100 µL 浓度 为 10 ng/mL 的 d5-CAP 内标和 5 mL 水，震荡 1 min 使之完全混匀，加入 5 mL 乙酸乙酯， 震荡 5 min 后在 4000 rpm 下离心 10 min，取上层 4 mL 乙酸乙酯于 10 mL 试管中，于 50℃ 用 氮气吹干，加入 0.5 mL 甲醇充分震摇溶解，再加入 4 mL 水摇匀，转移至 HLB 固相萃取柱 （使用前分别用 3 mL 甲醇和 5 mL 水活化），以小于 3 mL/min 的速度通过，待溶液完全流 出后，用 3 mL 水洗试管 3 次并过柱，用 5 mL 乙腈-水溶液（1 : 7）洗柱，弃去全部淋出液， 减压抽干。最后用 6 mL 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于 10 mL 试管中，于 50℃ 用氮气吹干， 用 1 : 1 的乙腈水溶液定容至 1 mL。 1.6.2 固体样品前处理方法
[关键词] 液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱，固相萃取，氯霉素，甲砜霉素，氟甲砜霉 素残留
Simultaneous Determination of Chloramphenicols Residues in foods by
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
在 GC-ECD、GC-MS、GC-MS/MS 方法中，为了改善其色谱行为，一般需要用 BSTFA 在 65±5℃反应 30 min 来硅烷化[5]，方法烦琐，其灵敏度也只有 0.2-0.1ppb[6,7]；HPLC 的灵 敏度达不到要求[8]；而 LC-MS/MS 法，可通过第一级质谱选择出母离子，采用多离子反应 监测（Multiple Reaction Monitoring, MRM）技术极大地减少了背景干扰，降低噪音，提高 灵敏度，是氯霉素类药物残留检测的首选方法。[9,10]
0
100
6
12
0
100
6
12.10
75
25
6
24.50
75
25
6
25
END
1.5 质谱条件： 离子源(Source)：ESI(-); 毛细管电压(Capillary)：3.80kV；锥孔电压(Cone)：70V；离子
源温度（Source Temperature）：100℃；锥孔反吹气流量(Cone Gas Flow)：60 L/hr；脱溶剂 气温度（Desolvation Temperature）：350℃；脱溶剂气流量（Desolvation Gas Flow）：400L/hr。
ELISA 方法使用酶联免疫检验试剂盒，如荷兰推出的测定氯霉素残留的酶联免疫测定 试剂盒 Quik-card，又称 La card test 试剂盒，该试剂盒用于测定牛、猪、羊等肌肉中氯霉素 残留，也可检测牛奶中氯霉素的残留，另外还有用它检测鸡蛋、尿液中氯霉素的报道[2]。一 般来说 ELISA 用于快速大规模筛选，在基层实地检测较多见，氯霉素的检出限只能达到 10 µg/kg，远低于欧盟的 0.3 µg/kg 的要求，由于抗体的批次不同，测定结果将出现一定差异， 重复性差，也可能出现微小差异，精密度也达不到要求，而且它的特异性很强，不能进行多 残留检测，试剂昂贵，易出现假阳性结果[3,4]。
1.4 色谱条件
色谱柱：Waters Atlantis C18 柱 2.1×150 mm 粒径 5 um
柱温：30℃；样品温度：室温。进样体积：10µL。流速：0.2mL/min。流动相梯度见表
1。
表1
色谱分离梯度洗脱条件
时间（min）
水（%）
乙腈（%）
梯度变化曲线
0
75
25
1
10
40
60
6
10.10
实验部分
1．材料与方法 1.1 试剂与材料
氯霉素标准品(Sigma,纯度 99%) 氯霉素 d5 内标标准品（Cambridge Isotope Laboratories,Inc. 纯度 98%） 甲砜霉素标准品（Dr.Ehrenstorfer 纯度 99.5%） 氟甲砜霉素标准品（Dr.Ehrenstorfer 纯度 99.0%） 超纯水由 Millipore 纯水系统（美国 Millipore 公司）制备 固相萃取柱（Waters Oasis HLB 3 ㏄ 60mg） 有机溶剂均为色谱纯
Sparatons Module 2695 高效液相色谱仪（Waters 公司）
Micromass –Quattro Ultima TM Pt 质谱仪（Waters 公司）
MassLynx 软件（Waters 公司）
MicrofugeR 18 Centrifuge 离心机（Beckman 公司）
T25 basic 均质机（IKA 公司）
质量条件参数
子离子
碰撞能量（eV） 延迟时间(s)
152.0
16.00
0.05
257.0
12.00
0.05
156.8
16.00
0.05
261.9
10.00
0.05
184.8
20.00
0.05
289.9
12.00
0.05
335.8
8.00
0.05
184.8
16.00
0.05
1.6 前处理方法 1.6.1 样品制备
Keywords HPLC-MS/MS, SPE, chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol
绪言
氯霉素类药物是一种广谱抗菌药，对多种病原菌都有较强抑制作用，常用于动物疾病的
预防及治疗。氯霉素类药物除了代表药氯霉素（Chloramphenicol，CAP）外，还有甲砜霉素 （Thiamphenicol，TAP）、氟甲砜霉素（Florfenicol，FF）。
氯 霉 素 类 药 物 的 测 定 方 法 主 要 有 酶 联 免 疫 法 （ Enzyme-linked Immunosorbent Assay ,ELISA）、气相色谱-电子捕获检测（GC-ECD）、气相色谱法-质谱法（GC-MS、 GC-MS/MS）、液相色谱法（HPLC）、液质联用（LC-MS、LC-MS/MS）等方法。
O N+
-O
OH HO
Cl H N
Cl
O
图 1-a 氯霉素结构式
OS O
OH HO
Cl
H N
Cl
O
OS
O
OH HO
Cl H N
Cl
O
图 1-b 甲砜霉素结构式
图 1-c 氟甲砜霉素结构式
近年来，我国出口食品中氯霉素超标事件屡次发生，主要在虾肉和蜂蜜中有氯霉素检出。 欧盟对我国实行了虾肉和蜂蜜禁运，严重影响到我国出口贸易，因此建立一种快速、准确、 灵敏度高的残留检测方法，就显得十分重要。
甲砜霉素（图 1-b）是氯霉素进行结构修饰后的产物，毒性和药理活性均比氯霉素小， 在我国和日本等国允许其使用，而美国则禁止其在水产品中使用[1]。现欧盟对甲砜霉素的限 量为 100 µg/kg。
氟甲砜霉素（图 1-c）是 1990 年由美国 Schering-Plough 公司对甲砜霉素进行结构修饰 而研制出的新型广谱抗菌药，主要用于水产、禽类、牲畜的病害防治。现欧盟对其的限量为 100 µg/kg。
为了有效消除提取、净化等过程中氯霉素的损失，克服了仪器精密度的问题，所以本方 法利用 d5-CAP 为内标，使检出限（LOD）能达到 0.02-0.2 ng/mL。本文使用高速均质，液 相萃取，固相萃取的预处理方法，能对多种性质的样品进行分析，如蜂蜜等液态样品，鱼肉、 虾肉等固体样品。通过有机溶剂去蛋白，正己烷萃取脂肪的办法，去除了样品中绝大多数杂 质的同时未对氯霉素的损失造成影响。
应用 LC-MS/MS 同时测定食品中氯霉素类药物的残留量
陈 启 徐小民 蔡增轩 任一平 浙江省疾病预防控制中心 杭州 310009
[摘 要] 目的 建立一种应用 LC-MS/MS 来快速准确检测食品中氯霉素、甲砜霉素、氟 甲砜霉素含量的方法。方法 采用液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪，用多离子反应监测 （MRM）定量法。通过对试样净化预处理、色谱条件、质谱参数等的优化选择和方法回收率、 精密度等的验证，建立了定量测定食品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素含量的理想方法。 结果 氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的定量限分别为 0.02 ng/mL、0.2 ng/mL 和 0.1 ng/mL， 在 0.1～1µg/kg 和 0.1～10 µg/kg 的线性范围内，相关系数 r 均为 0.99，回收率分别为 101.3%、 101.1%、102.2%,方法精密度分别为 2.5%、16.6% 、4.8%。结论采用液相色谱-电喷雾串联 四极杆质谱仪，可快速测定食品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素含量，结果准确可靠，重 复性好，灵敏度高。