副溶血性弧菌标准的检验方法

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。

在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。

为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。

第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。

2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。

3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。

4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。

5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。

（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。

对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。

样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。

（二）形态与染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列，一般大小为0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。

（三）培养特性在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长，在无盐的条件下不生长，在含2％~3％氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10％以上时不繁殖。

在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长，需氧性强，常在液体表面形成菌膜，在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。

在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。

在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些副溶血性弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长，在0.7％以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛）。

一般在20~25℃培养生长的周鞭毛较为稳定，而在37℃培养或24h以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株，在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。

培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对扩散生长有所影响，菌落形态也容易受条件的影响有所改变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落，不易挑起。

在血平反上生长快可出现溶血环，在BCBS（硫代硫酸盐，柠檬酸盐，胆盐，蔗糖）和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。

一般由腹泻病人初期分离者多为典型菌落，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙，形状不整齐或菌落出现解离，有的在液体培养时呈沉淀生长现象。

pH生长范围为5~10，最适pH为7.2~8.2，发育最适温度为30~37℃。

（四）生化特性本菌对葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，产生靛基质，不产生硫化氢，甲基红阳性，V-P阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，主要生物化学性状见表6-1。

近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识，对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。

表6-1 副溶血性弧菌的主要生物化学性状项目项目耐盐性0％－甲基红＋7％＋v ╟ p－10％－靛基质＋葡萄糖产酸＋赖氨酸＋葡萄糖产气－鸟氨酸＋/－蔗糖－精氨酸－甘露醇＋溶血性＋/－硫化氢－注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性。

表6-2 副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别菌名氧化酶葡萄糖产气赖氨酸精氨酸鸟氨酸靛基质明胶液化v！p乳糖蔗糖甘露醇肌醇阿拉伯糖甘露糖鼠李糖β半乳糖苷硝酸盐泳动盐胨水06810副溶血性弧菌v.parahaemoly-ticus＋－＋－＋＋＋－－－＋－d＋－－＋d－溶藻弧菌v.alginolyicus＋－＋－＋＋＋＋－＋＋－－＋－－＋＋do1霍乱弧菌v.choleraeo1＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－＋－＋＋－非o1霍乱弧菌v.cholerae nono1＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－d－＋＋d－拟态弧菌v.mimicus ＋－＋－＋＋＋－(d)－＋－－＋－＋＋－－河弧菌v.fluialis＋d－＋－d＋－－＋＋－＋d d＋＋－d 创伤弧菌v.ｖulnificus＋－＋－＋＋＋－＋d d－－＋－＋＋－－梅氏弧菌v.metschnikouii－－d＋－d＋＋d＋＋d－d－d－－－霍利斯弧菌v.hollisae＋－－－－＋－－－－－－＋＋－－＋－－v.damsela－－d＋－－－＋－－－－－＋－－＋－－注：＋90％以上为阳性；－90％以上为阴性；（＋）迟缓阳性；d 11％~89％为阳性；（d）11~89％迟缓阳性。

（五）溶血性试验我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。

此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。

有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。

（六）动物试验经上述检验的可疑菌株，用小鼠测定毒力，将16~18h的蛋白胨水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔0.3~0.5mL，有毒力者可在5~10h发病死亡，长者有24h左右发病死亡。

发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。

将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检出试验菌的纯培养。

对照动物观察2~3d无异常现象。

但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述毓的检验后，进行毒力证实，综合判定结果。

三、培养基（一）氯化钠结晶紫增菌液成分：蛋白胨20g 氯化钠40g0.01％结晶紫溶液5mL蒸馏水100 0mLpH9.0制法：除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加3％氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH，加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管，121℃高压灭菌15min。

（二）氯化钠蔗糖琼脂成分：蛋白胨10g牛肉膏10g氯化钠50g蔗糖10g琼脂18g0.2％溴麝香草酚蓝溶液20m L蒸馏水100 0mLpH7.8制法：将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入指示剂，分装烧瓶100mL，121℃高压灭菌15min备用。

临用前在100mL培养基内加入蔗糖1g，加热溶化，冷至50℃倾注平板。

（三）嗜盐菌选择性培养基成分：蛋白胨20g氯化钠40g琼脂17g0.01％结晶紫溶液5mL蒸馏水100 0mLpH8.7制法：除结晶紫和琼脂外，其他按上述成分配好，校正pH，加入琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶100mL。

（四）3.5％氯化钠三糖铁琼脂成分：蛋白胨20g 牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g氯化钠35g硫酸亚铁铵0.2 g硫代硫酸钠0.2 g琼脂12g酚红0.0 25g蒸馏水100 0mLpH7.4制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入0.2％酚红溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）成分：酵母膏3g蛋白胨10g氯化钠70g磷酸氢二钠5g甘露醇10g结晶紫0.0 01g琼脂15g蒸馏水100 0mL制法：调pH8.0，加热30min（不必高压），待冷至45℃左右时，加入新鲜人或兔血（5％~10％），混合均匀，倾注平皿。

（六）嗜盐性试验培养基成分：蛋白胨2g氯化钠按不同量加入蒸馏水100mLpH7.7（七）3.5％氯化钠生化试验培养基成分：牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠35g磷酸氢二钠2g0.2％溴麝香草酚蓝溶液12m L蒸馏水100 0mLpH7.7制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，葡萄糖发酵管可按0.5％葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。

其他培养基可分装为每瓶100mL，121℃高压灭菌15min，另将各糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌后，取5mL糖液，加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

（八）葡萄糖食盐胨水（MR-VP试验用）成分：多胨5 g葡萄糖5 g磷酸氢二钾5 g氯化钠3 0g制法：加入1000mL蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121℃高压灭菌15min。

（九）食盐胨水（靛基质试验用）成分：蛋白胨20g氯化钠30g蒸馏水100 0mLpH7.4制法：按上述分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。

（十）运动性试验培养基成分：牛肉膏3 g蛋1白胨0g氯化钠3 0g琼脂4 g制法：将全部成分加入1000mL蒸馏水，加热溶解，分装试管，121℃15min高压灭菌，最终pH7.4。

第二节副溶血性弧菌参考检验方法一、日本食品微生物检验方法（一）分离、菌数测定图6-2 分离、菌数测定程序（二）鉴定将TCBS平板上生长典型或可疑的菌落挑取2个以上，接种以下培养基：图6-3 鉴定程序（三）检查用培养基1. 3％氯化钠蛋白胨稀释液：蛋白胨10g、氯化钠30g溶于1000mL蒸馏水中，校正pH7.0，121℃15min高压灭菌。