副溶血性弧菌检验技术
副溶血性弧菌检验
01
02
03
采用适当的生物安全防护措 施，如穿戴防护服、戴手套
、口罩等。
对实验废弃物进行妥善处理 ，防止交叉污染和环境污染
。
04
05
定期对实验室进行生物安全 检查，及时发现并消除安全
隐患。
废弃物处理与环保要求
建立废弃物处理制度，对实 验废弃物进行分类收集和处 理。
04
遵守环保法规和相关标准， 确保实验室废弃物处理符合 环保要求。
副溶血性弧菌检验
汇报人：XX
• 引言 • 病原学特性 • 检验方法与步骤 • 临床意义与解读 • 实验室质量控制与安全管理 • 研究进展与展望
01
引言
目的和背景
了解副溶血性弧菌的 生物学特性及致病机 制
提高对副溶血性弧菌 感染的防控意识和能 力
掌握副溶血性弧菌的 检验方法和诊断标准
副溶血性弧菌概述
对实验人员进行定期培训 ，提高其专业技能和质量 控制意识。
对实验仪器进行定期维护 和校准，确保其处于良好 状态。
对实验数据进行统计分析 ，及时发现并解决问题。
采用标准化的实验方法和 操作程序，减少实验误差 。
生物安全管理与防护
对实验人员进行生物安全培 训，提高其生物安全防护意
识。
建立生物安全管理制度，明 确实验室人员的食品卫生管理，防止海产品污染；避 免食用未经煮熟的海产品；加强个人卫生 习惯，饭前便后洗手；对于食品加工人员 ，应定期进行健康检查，防止带菌者污染 食品。
05
实验室质量控制与安全管理
实验室质量控制措施
建立完善的实验室质量管 理体系，包括质量手册、 程序文件、作业指导书和 记录等。
抵抗力与传播途径
抵抗力
副溶血性弧菌食物中毒诊断技术
副溶血性弧菌食物中毒诊断技术*导读：副溶血弧菌营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。
在含盐3.5%的培养基上生长良好，0.5%盐时可生长，12%以上及无盐的培养基中不能生长。
……(一)检验方法1.样品采集以无菌方法采取具代表性的样品，置灭菌的容器内。
一般采集患者粪便、呕吐物和中毒的可疑原因食品。
常见可疑的食品有鱼、虾、蟹、贝等海产品及其他有关的食品。
若上述食品均为煮熟品，也可检验它们的包装物、烹调用具等。
副溶血弧菌不宜在低温环境中生存，故采集到的样品应尽快送往实验室，不宜冷冻保存运送，以免影响检验结果。
2.分离培养副溶血弧菌营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。
在含盐3.5%的培养基上生长良好，0.5%盐时可生长，12%以上及无盐的培养基中不能生长。
发育温度为30-37~C，以37~C最佳。
生长的pH范围是7.0-9.5，最适pH为7.7～8.0，需氧性强，厌氧生长很缓慢。
多数菌株于肉汤、蛋白胨水等培养基中呈浑浊表面形成菌膜。
R型菌发生沉淀。
厌氧培养48h以上，才见生长。
固体培养基上菌落常呈圆形隆起，不透明，表面光滑、湿润，多数菌株继代后，呈不正圆。
粗糙型菌落，灰白半透明或不透明，在EMB琼脂上不生长。
某些菌株在麦康凯培养基上不生长;生长者，其菌落为圆形、平坦、半透明或浑浊略带红色。
从腹泻病例初次分离到的菌落多较典型一般不形成色素。
食品中分离到的菌株，多为R型。
胆酸盐稍有阻止该菌扩散的作用，血平板上可见溶血环。
在氯化钠蔗糖平板上菌落呈绿色。
S.S琼脂上菌落中等大，无色透明、扁平、有动性，不易被接种环挑起。
该菌对乙酸，90%以上菌株对0/129抑制弧2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶)敏感。
该菌的溶血作用是因其具有耐热性溶血素，这种溶血素是相对分子质量约为42000的酸性蛋白质，对心脏有毒性，是一种即时型致死毒。
(二)动物试验经上述试验符合副溶血性弧菌的菌株接种于3.5%NaCl蛋白胨水中，经16-18h培养后，小鼠腹腔注射0.3ml，观察2-3天。
副溶血性弧菌检验
2）培养特性 4）致病性
2）培养特性
嗜盐：VP 在含氯化钠5 –(20-30－最适) g／L的培养基
上生长，无盐和110g ／L以上不生长。
生长温度：最适为37℃，4 ℃不生长
pH: 最适pH为7.4-8.0
需氧性:需氧性很强， 厌氧条件下生长缓慢
7
3）抵抗力
敏感：淡水等无盐环境 不耐热 对酸敏感，在2％冰醋酸或食醋中立即死亡， 对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感： 对磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。 耐受：耐高浓度NaCl－海水，盐渍酱菜中存活时间较长； 耐低温的抵抗力较强 耐青霉素、磺胺嘧啶。
12
5.5 ONPG试验：
5.6 甘露醇试验：
生化试验 5.7 赖氨酸试验：
5.8 MR-VP试验：
13
结果
样品经过增菌培养、 分离培养后，根据形 态观察、生化试验的 结果判断是否发现副 溶血性弧菌并报告。
14
革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检 时呈单个、成对、四联或不规则的簇群； 无芽孢，不运动； 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好。
历史：副溶血性弧菌食物中毒于1950年在日本首发，副溶 血性弧菌（V. parahemolyticus）于我国大陆沿海地区食物中 毒中最常见的一种病原菌。
3
中毒原因:烹调时未烧熟、煮、透,或熟制品污染后未再彻 底加热。
中毒食品:副溶血性弧菌食物中毒多发生在海产品大量上 市时。中毒食品主要是海产品,其次为咸菜、 熟肉类、禽肉、禽蛋类,约有半数为腌制品。
大多数菌株能生长在6.5-46℃之间（最适温度30-
37℃）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.07.5）；
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
副溶血弧菌检验标准方法免疫荧光法
`B66食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法连云港市产品质量监督检验所 发布DB32/TDB32/T -2010前言本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人：周翔本标准于2010年8月首次发布。
食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法1 范围本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 10 CFU/g2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 20001.4-2001 标准编写规定实验原理荧光抗体染色是荧光显微镜标本上的抗原—抗体反应和荧光结合第二抗体反应。
必须制成镜检标本。
作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。
夹心法，即用未标记的特异性抗原加在玻片上先与菌体中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而在荧光激发下间接地显示出菌体中抗体的存在。
3 设备3.1 拍打式均质器。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 低温高速冷冻离心机（25000r/min）3.4 全自动加液器（10~1000μl）3.5 天平（0.1g）3.6 直落式荧光显微镜3.7 水套式培养箱3.8 冰箱（0~8℃）3.9 湿盒3.10 20ml一次性注射器3.11 无荧光盖玻片3.12 无荧光载玻片3.13 洗片缸3.14 标本缸（存放实验片待灭菌）3.15 高压灭菌器4 试剂4.1 副溶血型弧菌羊抗血清4.2 兔抗羊荧光抗血清4.3 甲醇4.4 无荧光丙三醇（甘油）4.5 PBS缓冲液4.6 无菌高纯蒸馏水（无荧光）4.7 次氯酸钠消毒液4.8 封片甘油：无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份5 样品制备5.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。
副溶血性弧菌检验-检验操作程序及要点-微课件
副溶血性弧菌检验 ——检验操作程序及要点
目录页
CONTENTS PAGE
检验操作程序及要点
— 2—
副溶血性弧菌检验—检验程序及操作要点
检验程序及操作要点-1
• • • • 流程图 增菌 分离 纯培养
— 3—
检验程序及操作要点
微生物学检验
依据GB 4789.7-2013《食品安全国家标
试述副溶血性弧菌在TCBS琼脂平板上的典型菌落特征
— 11 —
智慧职教 /portal/
校本资源库 / 参考网站： /
分离 纯培养
初步鉴定
结果与报告
确定鉴定
定性 定量
— 5—
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
检验程序及操作要点流程图源自副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 6—
检验程序及操作要点
增菌
无菌操作 称量或量取 均质
液态样品，不需均质，振荡混匀即可；
鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 8—
检验程序及操作要点
纯培养
挑取 3 个或以上可疑菌落
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 9—
检验程序及操作要点
初步生化鉴定
确定生化鉴定
革兰氏染色试验 氧化酶试验 动力试验
三糖铁（TSI）试验 嗜盐性试验
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 10 —
贝类取全部内容物，包括贝肉和体液； 甲壳类取整个动物，或者动物的中心部 分，包括肠和鳃。
选择性增菌液
及时检验 副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 7—
副溶血性弧菌检测
副溶血性弧菌的分布与传播
分布
副溶血性弧菌主要分布在近海岸的海 水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中 ，尤其在温带和亚热带地区的沿海水 域更为常见。
传播
副溶血性弧菌主要通过食用被污染的 海产品，尤其是生的或未煮熟透的鱼 、贝类等传播给人类。此外，也可通 过直接接触带菌的水或食物传播。
副溶血性弧菌的致病性
结果报告
根据检测结果，撰写并提交检测报告。
04 副溶血性弧菌检测的应用 与意义
在食品安全领域的应用
食品生产过程监控
副溶血性弧菌检测是食品安全监 控的重要环节，用于确保食品在 生产、加工和储存过程中的卫生
安全。
食品质量评估
通过检测食品中副溶血性弧菌的数 量和种类，评估食品的质量和安全 性，确保消费者健康。
提供科学决策依据
副溶血性弧菌检测数据可为政府和相关部门提供科学决策依据，促进 食品安全、环境保护和公共卫生领域的政策制定和实施。
05 副溶血性弧菌检测的挑战 与展望
当前面临的挑战
检测方法的局限性
目前常用的副溶血性弧菌检测方法，如培养法、免疫学方法和分子生物学方法，存在灵敏 度不高、特异性不强、操作繁琐等问题，难以满足快速、准确检测的需求。
分离培养法具有较高的特异性，但检测时间较长，且对操作人员的技术要求较高。
免疫学检测方法
免疫学检测方法利用抗体与抗原的特 异性结合来检测副溶血性弧菌，包括 间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验 等。
免疫学检测方法具有快速、简便的优 点，但可能出现假阳性或假阴性的结 果。
分子生物学检测方法
分子生物学检测方法利用DNA或RNA的特异性序列来检测副溶血性弧菌，如聚合酶 链式反应（PCR）、基因芯片等。
检测规范
副溶血性弧菌检验PPT幻灯片课件
含量。
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• 神奈川现象(Kanagawa phenomenon，
KP) --在特定条件下，某些菌株在含 高盐(7％)的人O型血球或兔血球及以D 甘露醇作为碳源的我妻琼脂平板上产 生β溶血的现象 • 神奈川现象与本菌的 致病性密切相关
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血清分型
• O抗原（耐热的菌体抗原） O1- O13 共13种
• K抗原型（荚膜抗原） K1- K71 共65种
• H抗原（鞭毛抗原），无特异性
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三、检测程序
食品安全国家标准 副溶血性弧菌检验 GB 4789.7 -2013
13
GB 4789.7-2013
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1、样品制备
• 食品样品 鱼类：表面组织、肠、鳃 贝类：全部内容物（贝肉和体液） 甲壳类：动物的中心部分，包括肠、鳃 水产制品
GB 4789.7-2013 副溶血性弧菌检验
1
• 一、概述 • 二、生物学特性 • 三、检测方法
2
一、概 述
• 副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus于 1950年从日本一次暴发性食物中毒中发现。
• 该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、 贝壳等海产品中。在37℃、pH7.7、3～ 4%NaCl环境中生长最好。
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TCBS平板上典型特征
19
科玛嘉弧菌显色平板--紫色菌落
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4、纯培养
• 挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯化 钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1 ℃培养 18 h～24h。
5、初步鉴定
• 氧化酶试验 • 涂片镜检 • 3%氯化钠三糖铁 • 嗜盐性试验
副溶血性弧菌检验课件
在37℃下培养24-48小时，观察是否 有细菌生长。
分离培养
分离培养基
在SS（Salmonella Shigella）培养基上进行分离培养，副溶 血性弧菌在此培养基上呈现绿色菌落。
菌落形态
观察菌落的形状、大小、色泽等特征，以初步判断是否为副 溶血性弧菌。
生化鉴定
氧化酶试验
副溶血性弧菌为阳性结果。
基因测序
对PCR扩增产物进行测序，与副溶血性弧菌的基因序列进行比对，以确定是否 为副溶血性弧菌。
快速检测方法
Hale Waihona Puke 免疫胶体金试纸条利用抗原抗体反应的原理，将特异性抗体或抗原固定在试纸条上，当与样品中的 副溶血性弧菌抗原或抗体结合后，会出现显色反应，判断是否为副溶血性弧菌。
生物传感器
利用生物传感器技术，将副溶血性弧菌的特异性抗体或抗原固定在传感器上，当 与样品中的副溶血性弧菌结合后，会产生电信号或光信号，通过信号的强弱判断 副溶血性弧菌的浓度。
消毒处理
对接触过患者的物品和 环境进行消毒处理。
加强监测
加强食品和水质的监测 ，及时发现并控制副溶
血性弧菌的传播。
消毒与灭菌方法
高温消毒
将食品或物品加热至70度以上 ，持续一段时间进行消毒。
紫外线消毒
使用紫外线灯对空气和表面进 行消毒。
化学消毒
使用漂白粉、酒精等化学药剂 进行消毒。
煮沸消毒
将水加热至沸腾状态，持续一 段时间进行消毒。
培养特性
副溶血性弧菌为需氧或兼性厌氧菌， 在普通培养基上生长良好，适宜温度 为37°C，适宜盐浓度为2-4%。
流行病学特点
01
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传染源
副溶血性弧菌主要来自海 产品，如鱼类、贝类、甲 壳类等。
食品微生物学检验副溶血性弧菌检验(三)
食品微生物学检验副溶血性弧菌检验（三）6.1 制备接种两管3%试管斜面，36℃±1℃培养18h～24h。
用含3%的5%溶液冲洗3%斜面培养物，获得深厚的菌悬液。
6.2 K抗原的鉴定取一管6.1制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清举行检测，浮现凝集反应时再用单个的抗血清举行检测。
用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对比间隔。
在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。
在对比间隔内加一滴3%氯化钠溶液。
轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1min。
阳性凝集反应可以立刻观看到。
6.3 O抗原的鉴定将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121℃灭菌1h。
灭菌后4000r/mιn离心15min,弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4000min离心15min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。
用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。
在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分离加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自疑对比。
轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1mm。
阳性凝集反应可以立刻观看到。
假如未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121℃再次高压1h后，重新检测。
假如仍为阴性，则培养物的O抗原属于未知。
按照表1报告血清学分型结果。
表1副溶血性弧菌的抗原 7 神奈川实验(选做项目) 神奈川实验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。
神奈川实验阳性结果与副溶血性弧菌分别株的致病性显著相关。
用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18h培养物点种于表面干燥的我妻氏血琼脂平板。
每个平板上可以环状点种几个菌。
36℃±1℃培养不超过24h,并立刻观看。
阳性结果为菌落周围呈半透亮环的β溶血。
8 结果与报告按照检出的可疑菌落生化性状，报告25g(mL)样品中检出副溶血性弧菌。
假如举行定量检测，按照证明为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数(MPN)检索表，报告每g(mL)副溶血性弧菌的MPN值。
副溶血性弧菌检验
2）培养特性
嗜盐：在含氯化钠(20-30g／L最适) 的培养基
上生长，无盐和110g ／L以上不生长。
生长温度：最适为37℃，4 ℃不生长。
pH: 最适pH为7.4-8.0。
需氧Байду номын сангаас:需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢。
7
3）抵抗力
敏感：淡水等无盐环境 不耐热 对酸敏感，在2％冰醋酸或食醋中立即死亡， 对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感： 对磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。 耐受：耐高浓度NaCl－海水，盐渍酱菜中存活时间较长； 耐低温的抵抗力较强 耐青霉素、磺胺嘧啶。
历史：食物中毒于1950年在日本首发，副溶血性弧菌（V. parahemolyticus）于我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一 种病原菌。
3
2、分类:弧菌科、弧菌属。
3、副溶血性弧菌生物学特性
1）菌体形态学特征 3）抵抗力 5）致病性 2）培养特性 4）生化特性
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1）菌体形态学特征
本菌为G-，多形态，无芽孢，单端单鞭毛，有嗜盐特性， 在30-37℃最适温度时增长较快，一般冬季不易检出。
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中毒原因:烹调时未烧熟、煮、透,或熟制品污染后未再彻 底加热。 中毒食品:副溶血性弧菌食物中毒多发生在海产品大量上市 时。中毒食品主要是海产品,其次为咸菜、熟肉 类、禽肉、禽蛋类,约有半数为腌制品。 主要症状:中毒后潜伏期一般在10小时左右。发病急,主要 症状为恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发热,尚有头 痛、多汗、口渴等症状。 失水过多者可引起血压下降，电解质紊乱，出现 虚脱。少数严重病人由于休克、昏迷而死亡。 食用提醒: *加工海产品一定要烧熟煮透。 **烹调或调制海产品、拼盘时可加适量食醋。
谢谢大家
第七节 副溶血性弧菌
二、致病性
1、致病因素 ★侵袭力：活菌(105~107/g)，可使人致病 . ★产生溶血毒素：内毒素，成分是脂多糖，100℃30min不 被破坏。 2、媒介食品 主要是海产品（鱼、虾、蟹、蛤等）， 含盐量较高的食物亦可带菌。 3、所致疾病 食物中毒、急性胃肠炎、败血症等。
二、致病性
4、预防措施 （1）海产品加工前用消毒水冲洗干净，接触过海产品的 厨具、容器和手及水池等均要洗刷干净，以免污染食品 （2）若要吃凉拌菜应充分洗净，现在沸水中烫后，加醋， 放置10min后，再放其他调味剂 （3）严格执行生熟食品分开制度 （4）剩饭菜，在食用前要回锅热透
在固体培养基上菌落呈圆形凸起，混浊不透明，表面
光滑，较湿润，边缘不整齐。 在血平板上可见溶血环。
3、生化特性
分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖，蔗糖。 H 2 S （－）、 V-P （－）、靛基质（吲哚试验）（ + ）、
精氨酸（－）
甲基红（+）、赖氨酸（＋）、溶血＋/-
V.P反应
• 检测某种细菌分解碳水化合物产生乙酰甲 基甲醇[CH3CH（OH）COCH3]的反应。 通常把细菌培养在葡萄糖蛋白胨液体培养 基中，加入强碱可见显有红色。此反应用 于细菌的鉴别
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4、抗原结构结构
O抗原（菌体抗原）：O1~O13
H抗原（鞭毛抗原）： K抗原（荚膜抗原）：K1~K71
13种。
65种。
（ 缺编：K2 、 K14 、K17、 K35、 K62）
血清分型：所有副溶血性弧菌的H 抗原均相同，但是O 抗
原和K 抗原存在差异，以13种O抗原及65种K抗原将其分为 13个群和845个型。
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• 2、尿素酶（Urease，脲酶）试验
副溶血性弧菌检测微生物国标检测流程
副溶血性弧菌检测微生物国标检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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MMFSCNJ出口食品副溶血性弧菌检验方法
MM_FS_CNJ_01出口食品副溶血性弧菌微生物法MM_FS_CNJ_0148出口食品副溶血性弧菌检验方法1. 适用范围本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。
2. 主要试剂和仪器. 主要试剂30g/L 氯化钠稀释液：见；60g/L 氯化钠蛋白胨水(PW):见；氯化钠多粘菌素B肉汤(SPB):见；硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS):见；氯化钠三糖铁琼脂(TSI) :见；嗜盐性试验用胰胨水(TB):见；胰胨大豆琼脂斜面(TSA):见；靛基质试验用培养基(I) :见；氨基酸试验用培养基:见；V-P 半固体琼脂(VP):见；糖类分解试验用培养基:见；42 C生长试验用培养基：见；O/F 试验用培养基(HLGB):见；神奈川现象试验用我妻氏琼脂(WA):见。
. 仪器试管：17mm< 170mm 15mM 150mm 10mM 100mm 吸管: 1mL、10mL；培养皿:直径90mm；广口瓶或三角瓶；电动均质器；电动试管振荡器；37 C恒温箱；42 C恒温水浴箱；试管架。
3. 样品制备.冷冻样品应在45C以下不超过15min或在2〜5C不超过18h解冻。
若不能及时检验，应放于-15C左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于6〜10C冰箱保存，在24h内检验。
. 取样:以无菌操作进行。
鱼类:取鱼体不同部位。
贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类，则应先在清洁的流水中洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。
甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。
. 以无菌操作称取50g 检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。
.加30g/L氯化钠稀释水450mL均质(8 000r/min)1min，使成1 : 10稀释液(如无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加450mL稀释水使成1 : 10稀释液，并充分振荡）。
.用1mL灭菌吸管吸取1 : 10稀释液1mL注入装有9mL 30g/L氯化钠稀释水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1 : 100稀释液。
副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法主要有以下几种：
1. 细菌培养：将样品（如血液、粪便等）在适当的培养基上进行培养，副溶血性弧菌会在适宜条件下生长繁殖，通过观察菌落形态和生理生化特性来鉴定是否存在副溶血性弧菌。
2. PCR检测：利用聚合酶链反应（PCR）方法，通过扩增副溶血性弧菌特异性基因片段，进行定性和定量检测。
这种方法具有高度的灵敏度和特异性。
3. 免疫学检测：利用副溶血性弧菌的特异性抗原与抗体的结合反应来进行检测。
常见的方法有免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
4. 纳米粒子检测：利用特定的纳米粒子与副溶血性弧菌的抗原或DNA结合，形成可见颜色或光信号，通过肉眼观察或仪器读取来检测副溶血性弧菌。
需要注意的是，不同检测方法的适用场景和准确性有所差异，因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的检测方法。
实验五、海产品中副溶血性弧菌检验
实验八、海产品中副溶血性弧菌检验［实验目的］：1、了解海产品的检样处理方法。
2、学习副溶血性弧菌的检验方法和步骤。
3、掌握副溶血性弧菌常用的生化鉴定方法。
［检验程序］：［操作步骤］：1、无菌操作取鱼背肌肉置无菌平皿内。
检样处理——2、称取鱼肉25ｇ于无菌研钵内研碎（可加适量的海砂）3、将研碎的鱼肉置含225ml、3.5%Nacl的无菌水内，混匀检样。
增菌——取10 ml检样匀液于100 ml氯化钠结晶紫增菌液中，37℃培养8-16ｈ。
选择性平板——将增菌液划线接种氯化钠结晶子紫平板和嗜盐性平板，37℃培养。
生化试验——挑取可疑菌落接种氯化钠三糖铁琼脂，嗜沿盐性试验（0%、7%、10%），甲基红、吲哚、动力、硝酸盐还原、氧化酶、过氧化氢酶。
动物接种试验——［结果记录］：1、记录氯化钠蔗糖平板，嗜盐性平板分裂结果。
2、记录各项生化试验结果。
3、记录动物接种试验结果。
［报告检验结果］：［思考题］：1、在氯化钠蔗糖平板上怎样区分副溶血性弧菌与溶藻弧菌。
2、在3.5%氯化钠三糖铁上、副溶与溶藻表现如何？请分析原因。
3、副溶菌生化试验需要有哪几项？试述各项生化试验原理。
五、副溶血性弧菌实验准备四人一组用品：1、每组一条海黄鱼或海虾，约200ｇ。
2、无菌研钵一只（另配无菌海砂）。
3、225ml、3.5%氯化钠无菌水一瓶。
4、100ml广口瓶结晶紫氯化钠增菌液一瓶。
各组配制培养基、稀释液用品：1、配制容器——量筒、锅、烧杯、10ml吸管、1N NaoH2、分装容器——①平皿40块（氯化钠蔗糖）②平皿40块（嗜盐性）③中号试管50支（三糖铁）④小号试管40支（甲基红）⑤小号试管40支（吲哚）⑥小号试管80支（0% 3.5%）⑦小号试管80支（7% 10%）⑧小号试管40支（半固体）3、牛皮纸、捆扎线、棉塞药品：1-2组蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、蔗糖、琼脂3-4组磷酸氢二钾、多胨、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、琼脂、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠5-6组蛋白胨、氯化钠7-8组蛋白胨、氯化钠、牛肉膏、琼脂其它：氧化酶、过氧化氢酶试纸条、硝酸盐还原——微量生化管0.2%溴麝香草焚蓝0.01%结晶紫0.2%酚红。
副溶血性弧菌检验
•
O1- O13 共13种
• K抗原型（荚膜抗原）
•
K1- K71 共65种
• H抗原（鞭毛抗原），无特异性
三、检测程序
食品安全国家标准 副溶血性弧菌检验 4789.7 -2013
4789.7-2013
1、样品制备
• 食品样品
•
鱼类：表面组织、肠、鳃
•
贝类：全部内容物（贝肉和体液）
•
甲壳类：动物的中心部分，包括肠、
状、弧状、球状、卵圆形等）排列不规则
• 液体培养基生长单鞭毛，固体培养基常有 周生鞭毛（侧毛）
二、生物学特性 培养特性
• 需氧兼性厌氧 • 在含 3-4%的培养基中生长良好 • 无盐和 10%的培养基中均不生长 • 最适培养温度为：3037℃ • 最适范围：7.48.2
• 在固体培养基上，菌落通常隆起，圆形半 透明，表面光滑、湿润、一般不产生色素。
科玛嘉弧菌显色平板紫色菌落
4、纯培养 挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯
化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1 ℃培养18 h～24h。 5、初步鉴定 氧化酶试验
涂片镜检
3%氯化钠三糖铁 嗜盐性试验
• 底层变黄不变黑，无气泡， 斜面颜色不变，有动力
6、确定鉴定
• 甘露醇发酵试验含3%氯化钠的培养基
• 分类：属弧菌科()，弧菌属。
• 分布：主要存在于近海岸的海水、海底 沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海
产品中。
•
人多因食用被本菌污染而又未煮
熟的海产品和其他食品而引起中毒。
•
流行病学
• 季节分布：8-9月为高峰期 • 中毒食品：主要为海产品、其次为水产制
品、淹制品、咸菜及污染食品 • 地区分布：沿海地区居多 • 临床症状：主要有腹痛、腹泻、恶心、呕
食品中副溶血性弧菌的检验
食品中副溶血性弧菌的检验
一、概况 媒介食品 副溶广泛存在于海岸和海水中，海生动
植物常会受到污染而带菌。海鱼、虾、蟹、蛤等海 产品带菌率极高；被海水污染的食物、某些地区的 淡水产品如鲫鱼、鲤鱼等及被污染其他含盐量较高 的食物如咸菜、咸肉、咸蛋亦可带菌，也可因受到 污染而引起中毒。带用少量该菌的食物，在适宜的 温度下，经3～4小时细菌可急剧增加至中毒数量。 进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污 染所引起。
无粘性，(绿)兰色，直径2—4mm 嗜盐选择性平板：直径2.5mm，圆整或不
齐，隆起混浊，无粘性，无色，湿润。 4、选择性培养
取上述可疑菌落接种于3.5% Nacl-TSI 培养37℃ 24小时 5、镜检：取上述可疑菌落镜检，应为革兰氏 阴性，无芽胞多形态，两端浓染。
食品中副溶血性弧菌的检验
副溶血性弧菌在海博 弧菌显色培养基上典 型特征。典型 副溶
7、生化试验
• 分别接种各类生化培养基，置37 ℃恒温培 养。除V-P、靛基质、甲基红试验培养48小 时后加试剂观察外，其他均可在24小时观 察。试验结果判定参照下表。
食品中副溶血性弧菌的检验
生化特性
葡萄糖产 酸 葡萄糖产 气 蔗糖 乳糖 甘露醇 硫化氢 甲基红
7、生化试验
副溶血性弧菌的生化性状表
血性弧菌显蓝色至蓝 绿色 ， 霍乱弧菌和 其它弧菌显无色。
副溶血弧菌在蔗糖琼脂（tcbs）平 板上的菌落
食品中副溶血性弧菌的检验
6、嗜盐性试验
将可疑培养物接种于不同盐浓度的盐胨水 中，37℃ 24小时，观查生长情况。盐含量 0、3、7、9、11% ， 在3-7 %生长良好。
０ ３ ７ ９ 11
食品中副溶血性弧菌的检验
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2.6 无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm
2.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头
2.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL 1000mL 2.9 无菌培养皿：直径90mm
2.10 全自动微生物生化鉴定系统
2.11 无菌手术剪、镊子
225ml 3%氯化钠碱性蛋白陈水
液体
25mL
摇匀 36±1℃ 均质
25g
样品
8~18h
固体 样品
划线分离
氧化酶 试验
革兰氏 染色
•典型的副溶血性弧菌在 TCBS上呈圆形、半透明、 表面光滑的绿色菌落，用接 种环轻触，有类似口香糖的 质感，直径2mm~3mm。
TCBS琼脂 科玛嘉显色琼脂
3％氯 化钠TSI
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.1.3 以无菌操作样品25g（mL）加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均 质1min,或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自 225mL3%氯化钠碱性蛋白水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量 稀释液冲洗乳钵中的残留样品1~2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制 备1：10的样品匀液。
食品中副溶血性弧菌检验
一、副溶血性弧菌概况
副溶血性弧菌属弧菌科，是一种生活在近海的海洋微生物，深海一般未发现，大多 在温暖的季节水体中分离到该菌。从多种海产品中均能分离到该菌。
副溶血性弧菌引发的胃肠炎一般表现为骤发性剧烈腹痛。所有的副溶血性弧菌胃肠炎 起因均是由于进食了海产品或海产品相关的一些食物。在日本，有副溶血型弧菌引发 的胃肠炎相当普遍，约占全部胃肠炎爆发事件的50%，原因是日本人爱生吃鱼。
二、GB 4789.7-2013 标准解读
3 培养基和试剂
3.1 3%氯化钠碱性蛋白陈水（APW） 3.3 3%氯化钠胰蛋白陈大豆（TSA）琼脂 3.5 嗜盐性试验培养基 3.7 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基 3.9 3%氯化钠 3.11氧化酶试剂 3.13 ONPG试剂 3.15 弧菌显色培养基。
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液， 用接种坏在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色 培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36℃±1℃培养18h~24h。 5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种坏轻触，有类似口香糖 的质感，直径2mm~3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。 典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
嗜盐性 试验
接种于3％氯 化钠碱性蛋白 胨大豆琼脂
初步鉴定
甘露醇 试验
赖氨酸 试验
阳 性
阳 性
阳
MR
性
阴
VP
性
ONPG
阴
性
确定鉴定
三、副溶血性弧菌定性检测
结果鉴定
副溶血性弧菌的生化性状
试验项目
结果
革兰氏染色镜检
阴性，无芽胞
氧化酶
＋
动力
－
蔗糖
－
葡萄糖
＋
甘露醇
＋
分解葡萄糖产气
－
乳糖
－
硫化氢
－
赖氨酸脱羧酶
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.4 纯培养 挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18h~24h。
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.5 初步鉴定 5.5.1 氧化酶试验：挑取纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。 5.5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、 弧状、卵圆状等多形态，无芽孢，有鞭毛。 5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。 副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动 力。 5.5.4 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水， 36℃±1℃培养24h，观察液体浑浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生 长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。
9ml 各1ml
103
9ml
各1ml
平板分离及鉴定同副溶血性弧菌定性检验
阳性管
........
查最可能数（MPN）检索表，报告每克 （毫升）副溶血性弧菌的MPN值。
五、注意事项
API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌 落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API 20E生化鉴定试剂盒或 VITEK鉴定。
36±1℃ 18~24h
筛选试验 氧化酶试验，革兰氏染色，3％氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验
生化试验 或先用API 20E生化鉴定试剂或VITEK
结果与报告
血清学试验、神奈川试验 （选做项目）
二、GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.1 样品制备 5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置7℃~10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45℃以下不超过 15min或在2℃~5℃不超过18h解冻。 5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物 ，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水 分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求相应部分。
GB 4789.7-2013 标准解读
6 结果与报告
根据检出的可疑菌落生化性状，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为 副溶血性弧菌阳性试管管数，查最可能数（MPN检索表溶血性弧菌定性检测
操作规程
选择性增菌
副溶血性弧菌 细胞数量增殖
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.6 确定鉴定 取纯培养物分别接种含有3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基， 36℃±1℃培养24h~48h后观察结果：3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试 剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。
一、副溶血性弧菌概况
海洋环境中副溶血性弧菌的浓度通常为102CFU/mL或更低。而该菌引发的胃肠炎仅 在摄入大量细菌（106CFU）时才会发生。因此，只有在生吃污染严重的滤食性海鲜 食品，或进食未经恰当烹饪处理的污染食品时，才会引起胃肠炎。
虽然副溶血性弧菌与肉及肉制品关联不大，但在腌肉制品中曾分离到其他的嗜盐弧菌 （肋生弧菌和其他未分型弧菌），并且确定为引发变质的微生物。由于副溶血性弧菌 存在于海鲜食品中，随着鱼肉来源的食品添加物质如鱼糜等在肉制品中应用越来越多 ，未来由副溶血性弧菌引发的问题将不容忽视。
一、副溶血性弧菌概况
形态学特征：革兰氏染色阴性；菌体呈直或弯曲杆状；单极 鞭毛具动力，有时在固体培养基中生长后可产生周生鞭毛；
培养特性：嗜盐，在含氯化钠(20-30g／L最适) 培养基上生 长，无盐和110g／L以上不生长。最适为37℃，4 ℃不生长。 最适pH为7.4-8.0。需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢。
＋
V-P
－
ONPG
－
注：＋阳性；－阴性。
当检出的可疑菌落符合生化性状 要求时，报告25g（mL）样品 中检出副溶血性弧菌。
操作规程
四、副溶血性弧菌定量检测
25g
移1ml
移1ml
101
102
样品稀释接种 同大肠菌群检验 稀释液和发酵液 都为3%氯化钠 碱性蛋白陈水
均质器 固体样品
225ml 各1ml
抵抗力： 不耐热，对酸敏感（在2％冰醋酸或食醋中立即死 亡），对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感，对磺胺 噻唑、氯霉素、合霉素敏感。
二、GB 4789.7-2013 标准解读
食品安全国家标准
食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验
1 范围
二、GB 4789.7-2013 标准解读
本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolytcus）的检
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液， 用接种坏在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色 培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36℃±1℃培养18h~24h。 5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种坏轻触，有类似口香糖 的质感，直径2mm~3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。 典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
验方法。本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。
二、GB 4789.7-2013 标准解读
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 培养箱：36℃±1℃
2.2 冰箱：2℃~5℃，7℃~10℃
2.3 恒温水浴锅：36℃±1℃
2.4 均质器或无菌乳钵
2.5 天平：感量0.1g
3.2 硫代硫酸盐－柠檬酸盐－胆盐－蔗糖（TCBS）琼脂 3.4 3%氯化钠三糖铁（TSI）琼脂 3.6 3%氯化钠甘露醇试验培养基 3.8 3%氯化钠MR－VP培养基 3.10 我妻氏血琼脂 3.12 革兰氏染色液 3.14 Voges－Proskauer（V－P）试剂 3.16 生化鉴定试剂盒