副溶血性弧菌检验标准操作程序
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
副溶血弧菌检验标准方法免疫荧光法
`B66食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法连云港市产品质量监督检验所 发布DB32/TDB32/T -2010前言本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人：周翔本标准于2010年8月首次发布。
食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法1 范围本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 10 CFU/g2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 20001.4-2001 标准编写规定实验原理荧光抗体染色是荧光显微镜标本上的抗原—抗体反应和荧光结合第二抗体反应。
必须制成镜检标本。
作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。
夹心法，即用未标记的特异性抗原加在玻片上先与菌体中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而在荧光激发下间接地显示出菌体中抗体的存在。
3 设备3.1 拍打式均质器。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 低温高速冷冻离心机（25000r/min）3.4 全自动加液器（10~1000μl）3.5 天平（0.1g）3.6 直落式荧光显微镜3.7 水套式培养箱3.8 冰箱（0~8℃）3.9 湿盒3.10 20ml一次性注射器3.11 无荧光盖玻片3.12 无荧光载玻片3.13 洗片缸3.14 标本缸（存放实验片待灭菌）3.15 高压灭菌器4 试剂4.1 副溶血型弧菌羊抗血清4.2 兔抗羊荧光抗血清4.3 甲醇4.4 无荧光丙三醇（甘油）4.5 PBS缓冲液4.6 无菌高纯蒸馏水（无荧光）4.7 次氯酸钠消毒液4.8 封片甘油：无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份5 样品制备5.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。
副溶血性弧菌检验-检验操作程序及要点-微课件
副溶血性弧菌检验 ——检验操作程序及要点
目录页
CONTENTS PAGE
检验操作程序及要点
— 2—
副溶血性弧菌检验—检验程序及操作要点
检验程序及操作要点-1
• • • • 流程图 增菌 分离 纯培养
— 3—
检验程序及操作要点
微生物学检验
依据GB 4789.7-2013《食品安全国家标
试述副溶血性弧菌在TCBS琼脂平板上的典型菌落特征
— 11 —
智慧职教 /portal/
校本资源库 / 参考网站： /
分离 纯培养
初步鉴定
结果与报告
确定鉴定
定性 定量
— 5—
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
检验程序及操作要点流程图源自副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 6—
检验程序及操作要点
增菌
无菌操作 称量或量取 均质
液态样品，不需均质，振荡混匀即可；
鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 8—
检验程序及操作要点
纯培养
挑取 3 个或以上可疑菌落
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 9—
检验程序及操作要点
初步生化鉴定
确定生化鉴定
革兰氏染色试验 氧化酶试验 动力试验
三糖铁（TSI）试验 嗜盐性试验
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 10 —
贝类取全部内容物，包括贝肉和体液； 甲壳类取整个动物，或者动物的中心部 分，包括肠和鳃。
选择性增菌液
及时检验 副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 7—
新版副溶血性弧菌的测定作业指导书
作业指导书O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S副溶血性弧菌的测定编号：XZJY070-00-2019版本：第一版第0次修改编制：审核：批准：实施日期：2019.06.23一、编制目的为规范单位对副溶血性弧菌检测的操作，编制本作业指导书。
二、适用范围本指导书适用于食品中副溶血性弧菌的测定。
三、编制依据GB 4789.7-2013 《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》。
四、检验4.l 设备和材料4.1.1 冰箱：2℃～5℃；4.1.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃；4.1.3均质器；4.1.4振荡器；4.1.5 电子天平：感量0.1g；4.1.6 无菌锥形瓶：容量500ml，250ml；4.1.7无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头；4.1.8无菌培养皿：直径90mm；4.1.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm；4.1.10 无菌毛细管；4.1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸；4.1.12全自动微生物生化鉴定系统。
4.2 培养基和试剂4.2.1 3%氯化钠碱性蛋白胨水；4.2.2 TCBS琼脂；4.2.3 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂；4.2.4 3%氯化钠三糖铁琼脂；4.2.5 弧菌显色培养基；4.2.6 3%氯化钠溶液；4.2.7我妻氏血琼脂；4.2.8氧化酶试剂；4.2.9革兰氏染色液；4.2.10 ONPG试剂；4.2.11 V-P试剂；4.2.12生化鉴定试剂盒。
4.3检验程序检样4.4操作步骤4.4.1样品制备称取25g（ml）样品放入盛有225ml3%氯化钠碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，以8000r/min～10000 r/min均质1 min～2min；或置于盛有225ml3%氯化钠碱性蛋白胨水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2min，若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。
KJ01副溶血性弧菌检验.
典型的副溶血性弧菌在TCBSL呈圆形、半透明、 表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似 口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。
纯培养
挑取三个或以上可疑菌落，划线3 ％氯化钠 胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃ 土l ℃ 培养 18h--24h.
初步鉴定
氧化酶试验 挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶 阳性。 涂片镜检 将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副溶血性弧 菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有 鞭毛. 3﹪氯化钠三糖铁琼脂 挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3 ％氯化钠三糖铁凉脂斜面并 穿刺底层，35 ℃ 士1 ℃ 培养24h 观察结果。
副溶血性弧菌致病性
致病因子： 1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素 2、耐热相关溶血素TRH，与TDH 相似。
二、生物学特性
（一）形态与染色
1、革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌， 无芽孢单端鞭毛、两端浓染。杆状、棒状、甚
至球状、丝状等
革兰染色阴性兼性厌氧菌,无芽孢， 有鞭毛
菌体为多形态杆菌 或 稍弯曲弧菌
3 ％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变 黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色 加深，有动力。
嗜盐性试验
挑取纯培养的单个可疑菌落．分别接种于不 同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃ 士1 ℃ 培养 24h 观察液体混浊清况。 副溶血性弧菌在无氯化钠和10％氯化钠的胰 胨水中不生长或微弱生长，在7 ％氯化钠的胰 胨水中生长旺盛.
检 查
副溶血性弧菌
一.副溶血性弧菌的概述
副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus）， 进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐 菌食物中毒，主要翻版海产品。临床上以急性 起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。 本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体 发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也 渐增多。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即 可杀死；对热的抵抗力也较弱。
副溶血性弧菌
确定鉴定:
➢生化试验：分别接种各类生化培养基，培养后观察结果。 或API 20E 生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物检测系统鉴定。 生化性状符合下表要求时，为副溶血性弧菌 。
表 副溶血性弧菌的生化性状
项目 革兰氏染色镜检
氧化酶 动力 蔗糖
葡萄糖 甘露醇 分解葡萄糖产气
结果 阴性，无芽孢
第 七节、副溶血性弧菌检验
一、生物学特性 1、形态与染色
革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌或 稍弯曲弧菌 ，有时呈棒状、甚至球状、 丝状等。一般两极浓染。单端鞭毛， 长度约为菌体的2倍，运动活泼。无芽 胞、无荚膜。
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2、培养特性
➢本菌对营养要求不高，在普通的琼脂或蛋白胨水中均可 生长 ➢需氧特别强，在厌氧条件下生长非常缓慢 ➢嗜盐，在2~３%NaCL培养基中生长最好，无盐或食盐 >10%不能生长。 ➢最适温度36℃，pH7.5~7.8 ➢在肉汤、蛋白胨水等培养基中呈现浑浊，表面形成菌膜 ➢在固体培养基上菌落呈圆形凸起，混浊不透明，表面光 滑，较湿润，边缘不整齐。 ➢在血平板上可见溶血环。
＋ ＋ － ＋ ＋ －
项目 乳糖 硫化氢 赖氨酸脱梭酶 V-P ONPG
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结果 － － ＋ － －
报告： 定性检测：报告25g（ml）样品中是否检出副溶血性弧菌。 定量检测：根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查 MPN检索表，报告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。
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二、致病性
1、致病因素 ★侵袭力：活菌(105~107/g)，可使人致病 . ★产生溶血毒素：内毒素，成分是脂多糖，100℃30min不 被破坏。 2、媒介食品
副溶血性弧菌检验标准操作程序
样品制备
甲壳类取整个动物，或者动物的中 心部分，包括肠和鳃。
样品制备
如为带壳贝类或 甲壳类，则应先在 符合生活饮用水卫 生标准的流水中洗 刷外壳并甩干表面 水分，然后以无菌 操作打开外壳，按 上述要求取相应部 分。
样品制备
以无菌操作取检样25 g（mL），加入 3％氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转 刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min， 或拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10 的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入 无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌 容器内，加225 mL 3％氯化钠碱性蛋白 胨水，并充分振荡。
TCBS琼脂上面的副溶血性弧菌
四种显色培养基
纯培养
挑取3个或 以上的可疑 菌落，划线 3％氯化钠 胰蛋白胨大 豆琼脂平板， 36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h。
初步鉴定
氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试 验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
初步鉴定
涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副 溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽 胞，有鞭毛。
范 围
本标准规定了食品中副溶血性弧菌 （Vibrio parahaemolyticus）的检验 方法。 本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶 血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。
食品种类
动物性水产品： 鲜冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷 冻水产品； 生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、 冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝 壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以 直接食用的。
初步鉴定
挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3％氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底 层，36℃±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3％氯化钠三糖铁 琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深， 有动力。
副溶血性弧菌
精品课件
26
六、检验实验
目前副溶血性弧菌的检验采用国标法（GB/T 4789.7—2013 ）
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b) 冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃；
c) 恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃；
d) 均质器或无菌乳钵；
4.纯培养
挑取三个或以上可疑菌落，划线3 ％氯化钠 胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃ 土l ℃ 培养 18h--24h.
精品课件
33
5.初步鉴定
氧化酶试验
挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌 为氧化酶阳性。
涂片镜检
将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副 溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形 态，无芽胞，有鞭毛.
VP试验方法 ： 取一种细菌的24h纯培养
物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置
37'C培养48～72h取出后在培养液中先加
VP试剂甲液0.6mL，再加乙液0.2mL，充
分混匀。静置在试管架上，15min后培养
液呈红色者为阳性，以“ ”表示；不变色
为阴性，以“—”表示。1h后可出现假阳
性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养
1966年国际弧菌命名委员会正式命名为副溶血 性弧菌。
精品课件
4
中毒食品主要是海产品鱼、虾、蟹、贝类和海 藻等海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋
类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原 因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染．
精品课件
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副溶血性弧菌致病性
致病因子： 1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌标准的检验方法副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
KJ02-食品卫生微生物学检验-副溶血性弧菌检验.上课讲义
流行病学
➢ 季节分布，多见于春夏季；
➢ 中毒食品种类多，多见于奶、肉、蛋、鱼及 其制品。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%， 所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。
耐受力
➢ 几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金黄色葡 萄球菌都有严重的破坏作用
➢ 肠毒素可耐受100℃ 30分钟不被破坏。
➢ 对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或 其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。
生物学特性
---菌体形态及培养特征
大多数菌株能生长在6.5-46℃之间（最适温度3037℃）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.07.5）；
大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深 橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件， 而且在单个菌株中可能也有变化。
生物学特性
---菌体形态及培养特征
3
2、范围
➢ 本标准规定了副溶血性弧菌检验方法。 ➢ 本标准适用于动物性水产干制品、腌醉制生食动物性水
产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味 品以及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验。
4
3、生物学特性
1）菌体形态学特征 3）抵抗力
2）培养特性 4）致病性
1）菌体形态学特征
本菌为G-，可两端浓染 ，多形态，无芽孢，单端单鞭 毛，有嗜盐特性，在30-37℃最适温度时增长较快，一般冬 季不易检出。
生化试验
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结果 样品经过增菌培养、 分离培养后，根据形 态观察、生化试验的 结果判断是否发现副 溶血性弧菌并报告。
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金黄色葡萄球菌 检测
生物学特性
---菌体形态及培养特征
革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检 时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；
副溶血性弧菌检测微生物国标检测流程
副溶血性弧菌检测微生物国标检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法主要有以下几种：
1. 细菌培养：将样品（如血液、粪便等）在适当的培养基上进行培养，副溶血性弧菌会在适宜条件下生长繁殖，通过观察菌落形态和生理生化特性来鉴定是否存在副溶血性弧菌。
2. PCR检测：利用聚合酶链反应（PCR）方法，通过扩增副溶血性弧菌特异性基因片段，进行定性和定量检测。
这种方法具有高度的灵敏度和特异性。
3. 免疫学检测：利用副溶血性弧菌的特异性抗原与抗体的结合反应来进行检测。
常见的方法有免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
4. 纳米粒子检测：利用特定的纳米粒子与副溶血性弧菌的抗原或DNA结合，形成可见颜色或光信号，通过肉眼观察或仪器读取来检测副溶血性弧菌。
需要注意的是，不同检测方法的适用场景和准确性有所差异，因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的检测方法。
9、副溶血性弧菌检测
《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》GB29921-2013 水产制品 （熟制水产品、即食生制水产品、即食藻类制品）： n=5; c=1; m=100MPN/g（mL); M=1000MPN/g（mL） 水产调味品： n=5; c=1; m=100MPN/g（mL); M=1000MPN/g（mL）
7）结果与报告
根据检出的可疑菌落生化性状，报告25 g（mL）样品中检出 副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳 性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）副 溶血性弧菌的MPN值。
《腌制生食动物性水产品微生物指标》GB 10136-2005 致病菌（沙门氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球 菌）不得检出
副溶血性弧菌检验 GB4789.7-2013
1
主要内容
1、概述 2、分类 3、生物学特性 4、流行病学 5、检验
1、概述
副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus ） 分布广泛的海洋来源细菌，食物中毒重要的病原菌之一。 夏秋季节的沿海地区，经常由食用受污染的海产品引起爆 发性食物中毒。 流行病历史：世界首例副溶血性弧菌食物中毒1950年发生 在日本；中国最早的报道见于1962 年；美国发生于1971年；均 由海产品引发。
4）初步鉴定试验
3.5％氯化钠三糖铁琼脂：底层 变黄，斜面不变色，有动力， 不产生硫化氢. 镜检形态：本菌为G-，多形态，无芽孢。
氧化酶试验：氧化酶阳性。
嗜盐性试验： 0%不生长 6%和8%旺盛生长 10%不生长
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5）确定鉴定：取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇、赖氨酸、
MR-VP培养基，36℃士1℃培养24h~48h后观察结果。隔夜培养物进行 ONPG试验。
KJ02食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验
b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使 血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍 吞噬细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核 酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎 的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。
生物学特性
---菌体形态及培养特征
✓ 好氧生长的细胞产生接触酶；
✓ 产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌 酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白；
✓ 所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌 株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。
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致病性
➢ 金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要 取决于其产生的毒素和侵袭性酶：
镜检 营养肉汤
36± 1℃ 24h
血浆凝固酶 实验
36± 1℃ 6h
报告结果
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检测步骤---增菌
➢ 利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15% 的氯化钠），用7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠 胰酪胨大豆肉汤增菌。
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硫、维生素和痕量矿物元素 ✓ 丙酮酸钠是一种生长促进剂 ✓ 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解
卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色 ✓ 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 ✓ 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其
它菌株有抑制作用。
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副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准操作方案
提前准备 从检测培养基上挑取单菌落，划种于含 5%绵羊红细胞的胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针或接种环穿刺或 划种于小螺帽管中的 TSA-SB 或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克 隆。37℃培养 14～18 小时。
第二天 凝胶块内 DNA 的酶切 1、 2、 在 1.5ml eppendorf 管上标记好相应的样品及 H9812 的名称。 按照下面的比例配制酶切缓冲液的稀释液，混匀。
试剂 纯水 Buffer H 总体积
µL/胶块 180µl 20µl 200µl
µL /10 胶块 1800µl 200µl 2000µl
酶 SfiI（40U/µl） 1.25µl 总体积 注意： 200µl
（1） 将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。 （2） 用枪头吸出缓冲液 H，避免损伤胶块。 （3） H9812 的胶块使用 XbaI 进行酶切。 （4） 酶切体系可根据不同生产厂家推荐反应体系计算。 9、 用 NotI 酶配制酶切反应体系： 试剂 纯水 Buffer H µL/胶块 176µl 20µl µL /10 胶块 1936µl 220µl 44µl 2200µl
凝胶块中细胞的裂解 注意：同一菌株的两个凝胶块（可重复使用制胶模具）或 3-4 个凝胶块（丢弃式 制胶模具）可用同一个 50ml 管裂解。 1、 在 50ml 的聚丙烯螺帽管上做好标记。 2、 配制 CLB/蛋白酶 K 混合液：每 5ml 细胞裂解液（CLB）加入 25µl 蛋白酶 K（20mg/ml） ，使其终浓度为 0.1mg/ml，然后颠倒混匀。 注意：蛋白酶 K 要置于冰上，配制好的混合液也要置于冰上。 3、 每个管子加入 5ml CLB/蛋白酶 K 混合液。 4、 把凝胶块移入相应螺帽管：若想使胶块平齐，可用刀片削去模具表面多余 的部分。 可重复利用的模具：打开模具，用 6mm 宽小铲将胶块移入相应的螺帽 管中。
食品中副溶血性弧菌的检验
食品中副溶血性弧菌的检验
一、概况 媒介食品 副溶广泛存在于海岸和海水中，海生动
植物常会受到污染而带菌。海鱼、虾、蟹、蛤等海 产品带菌率极高；被海水污染的食物、某些地区的 淡水产品如鲫鱼、鲤鱼等及被污染其他含盐量较高 的食物如咸菜、咸肉、咸蛋亦可带菌，也可因受到 污染而引起中毒。带用少量该菌的食物，在适宜的 温度下，经3～4小时细菌可急剧增加至中毒数量。 进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污 染所引起。
无粘性，(绿)兰色，直径2—4mm 嗜盐选择性平板：直径2.5mm，圆整或不
齐，隆起混浊，无粘性，无色，湿润。 4、选择性培养
取上述可疑菌落接种于3.5% Nacl-TSI 培养37℃ 24小时 5、镜检：取上述可疑菌落镜检，应为革兰氏 阴性，无芽胞多形态，两端浓染。
食品中副溶血性弧菌的检验
副溶血性弧菌在海博 弧菌显色培养基上典 型特征。典型 副溶
7、生化试验
• 分别接种各类生化培养基，置37 ℃恒温培 养。除V-P、靛基质、甲基红试验培养48小 时后加试剂观察外，其他均可在24小时观 察。试验结果判定参照下表。
食品中副溶血性弧菌的检验
生化特性
葡萄糖产 酸 葡萄糖产 气 蔗糖 乳糖 甘露醇 硫化氢 甲基红
7、生化试验
副溶血性弧菌的生化性状表
血性弧菌显蓝色至蓝 绿色 ， 霍乱弧菌和 其它弧菌显无色。
副溶血弧菌在蔗糖琼脂（tcbs）平 板上的菌落
食品中副溶血性弧菌的检验
6、嗜盐性试验
将可疑培养物接种于不同盐浓度的盐胨水 中，37℃ 24小时，观查生长情况。盐含量 0、3、7、9、11% ， 在3-7 %生长良好。
０ ３ ７ ９ 11
食品中副溶血性弧菌的检验
出口食品副溶血性弧菌检验
MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌检验MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌检验方法1.适用范围本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。
2.主要试剂和仪器2.1.主要试剂（包括培养基）30g／L氯化钠稀释液：见6.1；60g／L氯化钠蛋白胨水（PW）：见6.2；氯化钠多粘菌素B肉汤（SPB）：见6.3；硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）：见6.4；氯化钠三糖铁琼脂（TSI）：见6.5；嗜盐性试验用胰胨水（TB）：见6.6；胰胨大豆琼脂斜面（TSA）：见6.7；靛基质试验用培养基（I）：见6.8；氨基酸试验用培养基：见6.9；V－P半固体琼脂（VP）：见6.10；糖类分解试验用培养基：见6.11；42℃生长试验用培养基：见6.12；O／F试验用培养基（HLGB）：见6.13；神奈川现象试验用我妻氏琼脂（WA）：见6.14。
2.2.仪器试管：17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm；吸管：1mL、10mL；培养皿：直径90mm；广口瓶或三角瓶；电动均质器；电动试管振荡器；37℃恒温箱；42℃恒温水浴箱；试管架。
3.过程简述3.1.样品制备3.1.1.冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18h解冻。
若不能及时检验，应放于－15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于6～10℃冰箱保存，在24h内检验。
3.1.2.取样：以无菌操作进行。
3.1.2.1.鱼类：取鱼体不同部位。
3.1.2.2.贝类：取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类，则应先在清洁的流水中洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。
3.1.2.3.甲壳类：取包括鳃及肠的部分或整体。
3.1.3.以无菌操作称取50g检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。
3.1.4.加30g／L氯化钠稀释水450mL，均质（8000r／min）1min，使成1∶10稀释液（如无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加450mL稀释水使成1∶10稀释液，并充分振荡）。
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初步鉴定
挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3％氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底 层，36℃±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3％氯化钠三糖铁 琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深， 有动力。
TSA＋TTC可以方便观察副溶血性弧菌动力
初步鉴定
嗜盐性试验：挑取纯培 养的单个可疑菌落，分别 接种于不同氯化钠浓度的 胰胨水中，36℃±1℃培 养24h，观察液体混浊情 况。副溶血性弧菌在无氯 化钠和10％氯化钠的胰胨 水中不生长或微弱生长， 在7％氯化钠的胰胨水中 生长旺盛。
增菌
定性检测 将上述1:10稀释液于36 ℃±1 ℃培养8 h～18 h。
增菌
定量检测 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管 混匀，制备1:100的稀释液。 另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍 递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌 吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计， 选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支 含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管 接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h。
范 围
本标准规定了食品中副溶血性弧菌 （Vibrio parahaemolyticus）的检验 方法。 本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶 血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。
食品种类
动物性水产品： 鲜冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷 冻水产品； 生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、 冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝 壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以 直接食用的。
弧菌于1950年从日 本一次暴发性食物中毒中分离 发现。该菌存在于近海的海水、 海底沉积物和鱼类、贝壳等海 产品中。在37℃、pH7.7、含 氯化钠3～4%的环境中生长最 好。主要引起食物中毒，尤以 日本、东南亚、美国及我国台 北地区多见，也是我国大陆沿 海地区食物中毒中最常见的一 种病原菌。
生化特性
分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。 H2S﹙－﹚、V-P﹙－﹚、动力（＋）。 甘露醇（＋）、赖氨酸（＋）、ONPG（－）。
报 告
当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求 时，可以报告检出副溶血性弧菌。如果进行 定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的 试管管数，查MPN检索表，报告g（mL） 副溶血性弧菌的MPN值。
可 选
项
血清型分型：O抗原，K抗原 神奈川试验：是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。该
试验阳性结果与副溶血性弧菌分离株的致病性显著相关。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他 设备和材料如下： • 恒温培养箱：36 ℃±1℃。 • 冰箱：2 ℃～5 ℃。 • 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 • 天平： 感量0.1 g。 • 无菌试管：18 mm×180mm、15 mm×100 mm。 • 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 • 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 • 无菌培养皿：直径90mm。 • VITEK全自动微生物鉴定系统[1]。 • 灭菌手术剪、镊子。
分离
在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一 环，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上 划线分离。一支试管划线一块平板。于36 ℃±1 ℃ 培养18 h～24 h。
使用TCBS琼脂划线不可密集
分离
典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈现为圆的、 半透明的、表面光滑的绿色菌落，用接种环 轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～ 3 mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽 快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的 菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显 色培养基上呈现为圆的、半透明的、表面光 滑的粉紫色菌落，直径2 mm～3 mm。
样品制备
• 非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱 保存，尽可能及早检验； 冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在 2℃～5℃不超过18 h解冻； 如果样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量 缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双 料），推荐贮存温度为-70 ℃以下。
样品制备
鱼类和头足 类动物取表 面组织、肠 或鳃。贝类 取全部内容 物，包括贝 肉和体液；
TCBS琼脂上面的副溶血性弧菌
四种显色培养基
纯培养
挑取3个或 以上的可疑 菌落，划线 3％氯化钠 胰蛋白胨大 豆琼脂平板， 36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h。
初步鉴定
氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试 验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
初步鉴定
涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副 溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽 胞，有鞭毛。
样品制备
甲壳类取整个动物，或者动物的中 心部分，包括肠和鳃。
样品制备
如为带壳贝类或 甲壳类，则应先在 符合生活饮用水卫 生标准的流水中洗 刷外壳并甩干表面 水分，然后以无菌 操作打开外壳，按 上述要求取相应部 分。
样品制备
以无菌操作取检样25 g（mL），加入 3％氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转 刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min， 或拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10 的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入 无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌 容器内，加225 mL 3％氯化钠碱性蛋白 胨水，并充分振荡。
确定鉴定
生化试验：分别接种含3％氯化钠 的甘露醇、赖氨酸、MR-VP培养基， 36℃±1℃培养24h～48h后观察结 果。隔夜培养物进行ONPG试验。
MR-VP试验
ONPG试验
确定鉴定
API20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3％氯化钠胰蛋白胨大豆 琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液， 使用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK鉴定。