血液等体液标本的细菌学检验(鲍曼不动杆菌)

血液等体液标本的细 菌学检验
一、实验目的
（一）掌握血标本的采集方法、检验程序 （二）掌握鲍曼不动杆菌的分离培养与鉴定。 （三）熟悉鲍曼不动杆菌的菌落特点、菌体形
态及染色性。
二、实验器材和试剂
❖ 器材： 酒精灯、火柴、取菌环、载玻片、普通光 学显微镜、血平板
❖ 试剂：3%过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、 生理盐水、生化管
❖ （3）根据涂片结果选择相应的抗菌药物， 直接从血培养瓶抽取适量液体做初步药敏 试验，并于18—24小时后报告初步药敏结 果。
（4）如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、 表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒 状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术 取瓶内液体接种固体培养基。包括需氧培 养、真菌培养及厌氧培养。
鲍曼不动杆菌对全部氨基青霉素，第一 代、第二代头孢菌素和第一代喹诺酮类抗生 素天然耐药。
目前治疗多选用β-内酰胺类药物+氨基糖 苷类联合用药
药敏纸片抑菌圈直径
头孢他啶CAZ ≤14 头孢吡肟FEP ≤14 头孢噻肟CTX ≤14 头孢曲松CRO ≤13 美洛培南MPN ≤13 妥布霉素TM ≤12 阿米卡星AN ≤14 左氧氟沙星CIP ≤13
四、实验步骤
❖ 1、标本采集 菌血症患者病原菌是周期 性出现在血液中，尽管临床症状可能很严 重，但患者血液中病原菌浓度水平相当低， 因此要求临床多次采血液标本进行肉汤增 菌培养，但24小时内一般不超过3次。怀疑 为菌血症的患者，原则上应在抗菌药物使 用前采取，对已开始抗菌药物治疗的患者 可在下次给药前采取，标本大多由肘静脉 采取，多部位采集血液标本也可增加阳性 率。
注意事项
❖ 1、一般应在抗菌药物使用前采集血液标本， 如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应 使用硫酸镁肉汤增菌液。
❖ 2、对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的 患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目接种后 无菌生长，方可报告阴性。
注意事项
❖ 3、为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期
内应至少盲目接种两次，第一次在标本孵 育12—18小时后。在以后的孵育期中应每 天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象， 需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育
❖ 5、一般菌血症由一种细菌引起，但约5%10%的菌血原理：自动血培养检测系统是检测细菌和真菌生长
时所释放的二氧化碳来作为血液中有无细菌的指标。 检测技术有放射标记、颜色变化（CO2感受器）、 荧光技术和压力检测等。自动血培养仪集培养、震 荡和检测一体化。接种血液标本后，血培养瓶在培 养、震荡的同时，由检测系统自动连续监测瓶中 CO2的产生情况，所测得信号传送至电脑分析，绘 制出每个瓶中微生物的生长曲线。一旦出现阳性结 果，电脑自动报警，指示阳性瓶的位置。
血液与培养基的比例应为1：5—1：10 儿童婴幼儿一般1-5ml 成人一般10ml
3、常见致病菌检验及报告方式
❖ （1）将血液细菌培养瓶置35度孵育，每日 观察一次，连续观察至第七天。注意观察 血液细菌培养瓶的变化。
❖ （2）如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长， 用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染 色检查。如发现细菌，根据细菌的染色性 及形态特征发出初步报告（电话通知主管 医生）。
鲍曼不动杆菌在医院感染中占第四位成为仅次 于铜绿假单胞菌的又一个非发酵菌，位居第二。在 某些地方不动杆菌的感染甚至已超过了铜绿假单胞 菌。随着广谱抗菌药物的广泛使用，多重耐药不动 杆菌日趋增多，耐药株对目前使用的所有抗菌药物 均可耐药，且很容易通过交叉感染在医院内爆发流 行。
步骤和方法
1、形态观察 革兰阴性、球状或球杆菌，常 成双排列。
血培养瓶
成 人 需 氧 瓶
小 儿 需 氧 瓶 厌氧瓶
全自动血培养仪
自动血培养仪特点
❖ 自动血培养仪除了适用血培养外，还可以用 于其他无菌部位标本如脑脊液、胸腹水、和 关节液等的细菌和真菌培养的检测。
❖ 自动血培养仪与手工系统相比，提高了阳性 检出率，灵敏度高，操作简单，能节省人力， 缩短检验周期，一般培养5天。但仪器、设备 和消耗品的成本较高。
❖ 药敏纸片：哌拉西林/他唑巴坦PIP/TA、替卡西林 +克拉维酸TIC/CA、头孢他啶CAZ 、头孢吡肟 FEP、头孢噻肟CTX、头孢曲松CRO、阿米卡星 AN、妥布霉素TM、美罗培南MPN、环丙沙星CIP
三、实验内容
（一）菌落观察 （二）革兰染色法 （三）氧化酶试验 （四）接种生化管 （五）菌种的综合判断
15-17 ≥18 15-17 ≥18 15-22 ≥23 14-20 ≥21 14-15 ≥16 13-14 ≥15 15-16 ≥17 14-16 ≥17
注意事项
1、染色、药敏试验、生化试验尽量挑取单个菌 落，若用量大可挑取多个，尽量不要使用一 区。
2、由于不动杆菌的细菌进行革兰染色时不易脱 色，有时易染成革兰阳性，误认为革兰阳性 球菌，实验时应注意鉴别。
鲍曼不动杆菌
❖ 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）为非发 酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致 病菌。主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、泌 尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机 相关性肺炎等。
❖ 是医院感染的重要病原菌。近年来的感染在增多， 且其耐药性日益严重，对危重患者及ICU中的患者 威胁很大。
2、菌落观察 在血平板上形成圆形、凸起光 滑、边缘整齐、不透明、灰白色、有粘性的 菌落。菌落较小，在麦康凯上生长良好，形 成无色或淡粉红色菌落。
步骤和方法
3、生化反应 （1）氧化酶、触酶试验:氧化酶阴性、触酶试
验阳性 （2）其他生化反应：不发酵糖类，硝酸盐还原
试验阴性，动力阴性
药物敏感试验
对于不动杆菌属，首选抗菌药物为头孢 他啶、哌拉西林、替卡西林、次选阿米卡星、 亚胺培南、环丙沙星。
后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每
次接种羊血平板和巧克力琼脂平板，分别
进行需氧和厌氧培养。革兰染色提示真菌 生长，应移种至沙氏平板，L型菌须转种高 渗平板。
注意事项
❖ 4、血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的 病原学依据，但血液标本在采集、接种、运 送过程存在潜在污染的可能，尤其在静脉穿 刺术中，因此皮肤消毒应严格按规程操作。
❖ 标本采集注意事项：
采血部位的皮肤消毒采用三步消毒法：即先用70%酒 精擦拭皮肤，再用碘酒消毒，然后用70%酒精脱碘。
采集的血液标本应分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧 培养）和硫乙醇酸钠肉汤（厌氧培养）培养瓶中。
硫酸镁葡萄糖肉汤中和多种抗生素，硫乙醇酸钠肉汤 含有硫乙醇酸钠、葡萄糖等还原剂吸收其中的氧，为厌氧 菌提供较低的氧化还原电位。
绿假单胞菌、气单胞菌等。
（6）报告方式
❖ 在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经 涂片、革兰染色证实，可报告“疑有XX细菌 生长”；
❖ 经分离培养、生化试验及血清学鉴定后，可 报告“血液细菌培养X天，有XX细菌生长”， 并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；
❖ 如果增菌培养至七天，培养瓶中仍无细菌生 迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告 “血液细菌培养七天，无细菌生长”。
（5）对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及 染色性。
革兰阴性杆菌：进行氧化酶试验并接种KIA培养 基、O/F试验、生化鉴定、血清学鉴定、药敏试 验。
革兰阳性球菌：葡萄串样或散在存在，触酶试验 阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶阴性链状或散 在排列初步判断为链球菌属或肠球菌属，作生化 鉴定、血清学鉴定、药敏试验。
血液标本中常见的细菌
❖ 革兰阳性球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、 A群、B群链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肠 球菌 、厌氧链球菌、
❖ 革兰阳性杆菌：产单核李斯特菌、炭疽芽胞杆菌、 产气荚膜杆菌。
❖ 革兰阴性球菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌。 ❖ 革兰阴性杆菌：大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜