第四章酶解析
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4第4章 酶化学32
锁与钥匙假说
诱导契合假说
五、酶的活力测定及分离纯化
（一）酶的活力测定
（二）酶的分离纯化
（一）酶的活力测定 1、酶活力（enzyme activity）： 酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。用 酶催化某一反应的速率来表示。 2、酶活力单位（U，activity unit） 在一定条件下一定时间内将一定量的底物转化 为产物所需酶的量。国际规定：在最适反应条件 下每分钟内催化1微摩尔底物转化成产物所需酶的 量为一个酶活力单位。 3、酶的比活力（specific activity）： 代表酶的纯度。每毫克酶蛋白所含的酶活力单位。 对同一种酶比活力越大酶纯度越高。
S＋ E
［SE］
P＋ E
1903年Henri 用蔗糖酶水解蔗糖研究底物浓度 和反应速度的关系。当酶浓度不变时，可测出 一系列不同浓度的底物下的反应速度。用反应 速度对底物浓度作图，得到一个酶反应速度曲 线。当浓度低时，呈一级反应，随底物浓度增 加，反应表现为混合级，当浓度增到相当高的 时候，酶反应速度与浓度无关，呈零级反应。 因而，他提出酶底物中间络合物学说。
这一学说已被很多实验所证实。有如下实验结 果证实： 1、有些复合物可以被分析和电镜观察到。 2、许多酶和地物的光谱特性在形成复合物后 发生变化。 3、酶的性质常在形成复合物后发生改变。 4、已分离出某些酶的复合物结晶。 5、超离心沉降可观察到酶和底物共沉现象。
（二）酶促反应动力学方程式
1913年Michaelis和Menten根据酶和底物形成中 间复合物的学说推导出一个数学方程式，表示底 物与酶反应速度之间的定量关系称为米曼氏方程：
v = Vmax[S] / Km+[S]
v--- 反应速度，Vmax－－酶被底物饱和时的最 大反应速度，［S］－底物浓度，Km－ 米氏常数。
酶学第四章酶的结构和功能
第四章酶的结构和功能4.1 酶的活性中心4.1.1 酶的活性中心和必需基团的概念在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。
这些特异的氨基酸残基可以在肽链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活性部位）。
组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务，有些执行催化反应的任务。
我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。
1960年，Koshland将酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团分成4类：接触残基（直接与底物接触，参与结合或催化的残基；右图中的R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164、R165），辅助残基（对接触残基的功能起辅助作用的残基，也位于活性中心；右图中的R4），结构残基（维持构象的残基，此为活性中心以外的必需基团；右图中的R10、R162、R169），非贡献残基（或称非必需残基，非必需只是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如识别自身物质、运输、防止降解等；右图中的R3、R5、R7）。
4.1.2 酶活性中心的拓扑学酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽，形状与底物相近。
不同的酶的口袋适合不同的底物。
口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基团靠近。
亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残基亲合。
例如羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。
当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时（苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反应速度很快。
但是当有这些较大疏水基团的氨基酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底物的亲和力。
说明羧肽酶A对底物的识别和结合有多个位点。
同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争性抑制剂。
4.2 酶活性中心化学基团的鉴定常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和x-光晶体衍射法。
4.2.1化学修饰法酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧基等。
第四章 酶法分析
优点：
不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景
食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。
第四章 酶的结构与功能
协同性的好处
1. 正协同性的优势 对于无协同性的米氏酶而言，将其反应速率从Vmax的 10% 增加到 90%时，需要较大的底物浓度增加。正协同 效应意味着酶对环境中底物浓度的变化更为敏感。这样 的结果可以使得机体内某些重要的调节酶能够根据环境 的变化对代谢进行更加灵敏的调节。
小核酶一般是来源于某些动、植物病毒的卫星RNA，主 要包括锤头状（hammerhead）核酶、发夹状（hairpin） 核酶、D型肝炎病毒（HDV）RNA、Varkud卫星（VS） 核酶和GlmS核开关。
大核酶包括：第一类和第二类自我剪接的内含子（selfsplicing introns）、催化真核细胞核mRNA前体剪接的剪 接体（spliceosome）、催化tRNA 前体在5′端后加工的核 糖核酸酶P和催化蛋白质生物合成的核糖体。
二、S型曲线和Hill方程
典型的别构酶催化的反应速率与底物浓度的S 型曲线
激活剂或抑制剂对别构酶活性的影响
S型曲线和Hill方程
既然米氏方程给出的是双曲线（v对[S]作图），所以它不适合具有底物 协同性的呈S型曲线的别构酶，但Hill方程却能够很好地说明别构酶的 动力学，Hill方程是：
Hill方程与米氏方程十分相似，它们的主要差别首先是Hill方程中的底 物浓度[S]被提高到h数量级，h被称为Hill系数；其次，方程底部的常 数不是Km，而是K0.5，该常数也被提高了h数量级。K0.5与Km相似，因 为它也是指速率为最大速率一半时候的底物浓度。
辅助因子的多为维生素或其衍生物。
酶高效的催化性
酶促反应与非酶促反应效率的比较
酶的专一性
是指酶对参与反应的底物有严格的选择性，即一种酶仅能作用于一 种底物，或一类分子结构相似的底物，发生某种特定类型的化学反 应，产生特定的产物。
大学生物化学 酶
同促效应（正协同效应、负协同效应） 异促效应
异促效应
别构酶的特点
1、别构酶多为寡聚酶，由多亚基组成，包括活性部位 （结合和催化底物）与调节部位（结合效应物）。 2、具有别构效应。指酶和一个配体（底物，效应物）结 合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。 3、别构酶大都不遵循米氏动力学。
别构酶与非调节酶动力学曲线的比较
练习题
当 一 酶 促 反 应 进 行 的 速 率 为 Vmax 的 80%时，在Km 和[S]之间有何关系？
米氏常数的意义
Vmax·[ S] V=
Km + [ S]
（1）概念 （2）Km值是酶的特征性常数。 （3）Km值与酶和底物亲和力的关系。
Km求法
Vmax·[ S] V=
Km + [ S]
双倒数曲线
加入反竞争性抑制剂后：Km 和Vmax均变小。
练习题
举例说明竞争性抑制的特点和实际意义。
三种可逆性抑制作用的比较
影响
竞争性 非竞争性 反竞争性
抑制剂的结合组分 E
抑制程度取决于 [I]/[S]
对Vmax的影响 不变
对Km的影响
增大
E、ES [I] 减小 不变
ES [I]
减小 减小
七、酶活性的调节
举例
乳酸脱氢酶
同工酶举例
乳酸脱氢酶同工酶
HH HH
LDH1 (H4)
HH HM
LDH2 (H3M)
HH MM
LDH3 (H2M2)
HM MM
LDH4 (HM3)
MM MM
LDH5 (M4)
不同组织中LDH同工酶的电泳图 谱
LDH1(H4)
+
LDH2(H3M)
异促效应
别构酶的特点
1、别构酶多为寡聚酶，由多亚基组成，包括活性部位 （结合和催化底物）与调节部位（结合效应物）。 2、具有别构效应。指酶和一个配体（底物，效应物）结 合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。 3、别构酶大都不遵循米氏动力学。
别构酶与非调节酶动力学曲线的比较
练习题
当 一 酶 促 反 应 进 行 的 速 率 为 Vmax 的 80%时，在Km 和[S]之间有何关系？
米氏常数的意义
Vmax·[ S] V=
Km + [ S]
（1）概念 （2）Km值是酶的特征性常数。 （3）Km值与酶和底物亲和力的关系。
Km求法
Vmax·[ S] V=
Km + [ S]
双倒数曲线
加入反竞争性抑制剂后：Km 和Vmax均变小。
练习题
举例说明竞争性抑制的特点和实际意义。
三种可逆性抑制作用的比较
影响
竞争性 非竞争性 反竞争性
抑制剂的结合组分 E
抑制程度取决于 [I]/[S]
对Vmax的影响 不变
对Km的影响
增大
E、ES [I] 减小 不变
ES [I]
减小 减小
七、酶活性的调节
举例
乳酸脱氢酶
同工酶举例
乳酸脱氢酶同工酶
HH HH
LDH1 (H4)
HH HM
LDH2 (H3M)
HH MM
LDH3 (H2M2)
HM MM
LDH4 (HM3)
MM MM
LDH5 (M4)
不同组织中LDH同工酶的电泳图 谱
LDH1(H4)
+
LDH2(H3M)
第四章 酶法分析.
第二节 酶法分析
在进行酶法分析时，先要根据分析 对象选择适它的“工具酶”，然后再通 过酶反应的测定，并借助相应的校正曲 线来检知它们的浓度或含量。在上述几 种检测对象中，除了底物可以采用总变 量分析法（终点法）外，其它都只能用 动力学分析法。
Hale Waihona Puke 件：和酶活力测定的基本相同，但其所用 的酶量必须一定，除了相应的被测因素 的浓度应控制在限速水平以外，其它反 应成份均须保证处于恒定和最适。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
A
E1
B
E2
C
被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B 是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的 脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过 NADH的特征变化而测知。
HK 被测反应：
G + ATP
G6PDH
G-6-P + ADP NADPH + 6-PGCOOH
偶联指示反 应： G-6-P
+ NADP
酶分析法：
酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）
前者的目的在于检知样品中某种酶的 含量或活性，后者则主要用于测定与生 物学有关的样品中酶以外其它物质的含 量。两者检测对象不同，但原理基本一 致：酶的专一性、高效性，通过酶反应 速度测定物质的变化进行定量分析。
酶分析
（Enzyme Assay）
第四章__酶工程原理及其在食品工业中的应用详解
（2）离子吸附法。通过离子效应，将酶分子固定到 含有离子交换基团的固相载体上。 常见的载体：DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-纤维素、DOWEX-50等。 优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收 率较高的固定化酶。 缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓 冲液种类或pH值发生变化时，酶容易脱落。
酶工程一般工艺流程示意图
胞外酶
胞内酶 菌种→基因改造→发酵→发酵酶液→预处理→细胞分离→细 胞破壁→碎片分离→提取→精制→酶制剂及其改造 酶制剂 ↓ 原料→前处理→杀菌→酶反应器→反应液→产品提取→成品
（二）酶工程的发展历程 1.20世纪50～60年代早期的酶工程技术，主要是从 动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种 酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 2.20世纪70年代后期，酶的固定化技术取得了突破， 使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等 酶工程技术迅速获得应用。 3.目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工 产品和医药产品，并且在食品工业、化学检测和环境保 护等各个领域中得到了有效的应用。
（二）非机械破碎法 1.酶溶法 加酶法:常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们 对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。 自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件， 诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力， 以达到细胞自溶的目的。 2.化学渗透法 用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素或金属 螯合物等处理，使细胞壁或膜的通透性（渗透性）改变， 从而使胞内物质有选择地渗透出来。
（三）根据酶分子电荷性质的方法 1.离子交换层析 根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间异种电 荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂 上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质 分离。 离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和 阴离子交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子交换剂，也 可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
生物化学-酶
酶一级结构的差别也决定了催化性质的不同， 如胰蛋白酶、 胰糜蛋白酶和弹性蛋白酶三种蛋白 酶的活性中心Ser残基附近都有一个在立体结构上 的“口袋”状结构。由于三种蛋白酶的口袋”状结 构不同，决定其与不同底物结合即有不同特异性。
酶的特异的三维空间结构是酶催化功能的基础。 酶的二、三级结构是维持酶的活性中心空间构象的 必需结构。
酶的命名包括习惯命名和系统命名，酶可分为六类。 酶与疾病发生、诊断、治疗等密切相关。
➢一、酶的概念 酶是由生物活细胞产生的具有高效催化功能
和高度专一性的一类特殊蛋白质，又叫生物催化 剂•．绝大多数的酶都是蛋白质。
酶的化学本 质是什麽？
酶的概念
• 一、相关概念 • 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。 • 被酶的催化的物质称为底物(S) • 反应的生成物为产物（P） • 酶所具有的催化能力称酶的活性． • 酶失去催化能力称酶的失活．
第四章 酶 (Enzymes)
内容简介
酶是具有高度催化效率及高度特异性的蛋白质。 酶通过多种机制降低反应活化能使反应速率增加。 酶分子一级结构及空间结构是催化功能的基础。 酶促反应速率受到[S]、[E]、pH、T、抑制剂及激活
剂的影响
酶活性可受到别构调节、共价修饰、酶原激活、关键 酶、多酶体系、同工酶等调节
H N C O
COOH CH
R6
氨基酸
氨基酸
消化道中各种蛋白酶的专一性
3．立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
OH
生化第4章_酶
体内的物质代谢。
维生素分为脂溶性和水溶性两大类。脂溶性维生素在体内 可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变 成辅基对代谢起调节作用。
大多数辅酶的前体是水溶性 B 族维生素。辅酶I、辅酶II
９
3. 酶结构与功能特点
蛋白质的结构特点： 一级、二级、三级、四级结构
根据结构不同酶可分为：
３７
3.酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）
(1) 锁钥假说 (lock and key hypothesis)：
•
认为整个酶分子的天然构象具
有刚性结构，酶表面具有特定 的形状。酶与底物的结合如同
一把钥匙对一把锁一样。
(2) 诱导契合假说（induced–fit hypothesis):
•
认为酶表面并没有一种与底物
H2N C OH
CH2 NH2 OH
亲核性基团
酸碱性基团
16
酶催化反应举例
溶菌酶（lysozyme）降解细菌细胞壁多糖
溶菌酶是一种葡萄糖苷酶，水解NAG形成的β(1, 4)糖苷键
溶菌酶内部几乎都是非极性的，在分子表面有一较深的裂缝
其大小恰好容纳底物的 6 个单糖，是酶的活性部位．
酶的水解作用
31
(7) 核酸酶（催化核酸） (Ribozymes)
核酸酶是唯一的非蛋白酶, 是一类特殊 RNA，能催化 RNA 分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。
B
3'
B
3'
B
3'
B
3'
B
3'
P
5'
P
5'
P
生物化学第四章酶
⽣物化学第四章酶第四章酶酶是⼀类具有⾼效率、⾼度专⼀性、活性可调节的⾼分⼦⽣物催化剂。
1957巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1 分⼦Glc→2分⼦⼄醇+2分⼦CO2 从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，⽣成⼄醇。
1897 Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动⽆关，不含细胞的酵母汁也能进⾏⼄醇发酵。
1913 Michaelis和Menten提出⽶⽒学说—酶促动⼒学原理。
1926 Sumner⾸次从⼑⾖中提出脲酶结晶，并证明具有蛋⽩质性质。
1969 化学合成核糖核酸酶。
1967-1970 从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986 Cech发现四膜⾍细胞⼤核期间26S rRNA前体具有⾃我剪接功能。
ribozyme ，deoxyribozymeE.coRI5’——GAA TTC——3’3’——CTTAAG——5’限制作⽤修饰作⽤5’——GAATTC——3’5’——GAATTC——3’3’——CTTAAG——5’ 3’——CTTAAG——5’第⼀节酶学概论⼀、酶的⽣物学意义⼤肠杆菌⽣命周期20分钟，⽣物体内化学反应变得容易和迅速进⾏的根本原因是体内普通存在⽣物催化剂—酶。
没有酶，⽣长、发育、运动等等⽣命活动就⽆法继续。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）⼆、酶的概念及其作⽤特点1、酶是⼀种⽣物催化剂酶是⼀类具有⾼效率、⾼度专⼀性、活性可调节的⾼分⼦⽣物催化剂。
⽣物催化剂：酶(enzyme)，核（糖）酶(ribozyme)，脱氧核（糖）酶(deoxyribozyme)2、酶催化反应的特点（1）、催化效率⾼酶催化反应速度是相应的⽆催化反应的108-1020倍，并且⾄少⾼出⾮酶催化反应速度⼏个数量级。
（2）、专⼀性⾼酶对反应的底物和产物都有极⾼的专⼀性，⼏乎没有副反应发⽣。
（3）、反应条件温和（4）、活性可调节根据据⽣物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
酶法解析
测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ？
——速度方程
测定酶活力的基本要求：
1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度 的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；
2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大 能力）；
所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下 几方面做工作：
E1
A
B
E2 C
被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B 是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的 脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过 NADH的特征变化而测知。
HK
被测反应： G + ATP
G-6-P + ADP
偶联指示反
G6PDH
应： G-6-P + NADP
NADPH + 6-PGCOOH
以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性；
如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；
葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等；
酶法分析（ENZYME ANALYSIS）
酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试 剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、 活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品 有关的样品中酶以外其他物质的含量。
第四章 酶分析法
酶分析法：
酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）
前者的目的在于检知样品中某种酶的 含量或活性，后者则主要用于测定与生 物学有关的样品中酶以外其它物质的含 量。两者检测对象不同，但原理基本一 致：酶的专一性、高效性，通过酶反应 速度测定物质的变化进行定量分析。
酶分析 （Enzyme Assay）
第四章酶的归纳总结
“第四章酶”归纳总结第一节酶的分子结构和催化功能酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（反应物）具有高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂中的一种类型。
生物催化剂酶＼核酶：具有催化作用的核糖核酸，主要以核酸为底物。
根据酶的组成特点辅酶、辅基——B族维生素的活性形式二、酶的活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链具有不同的化学基团，其中一些与酶活性密切相关的化学基团。
酶的活性中心：一些必需基团在酶蛋白的一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异的结合并将底物转为产物。
必需基团活性中心外的必需基团活性中心内的必需基团 结合基团：能与底物或辅酶结合形成酶复合物催化基因：参与催化化学反应完成的化学基因三、酶催化作用机制酶促反应的机制酶促反应的化学机制第二节 酶促反应的特性诱导契合学说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应， 进而相互结合而有利于反应的进行。
中间复合物学说：目前一般认为，酶催化某一反应时，首先在酶的活性中心 与底物结合生成酶－底物复合物，此复合物再进行分解而释放出酶，同时生成一种或数种产物。
邻近\定向效应 多元催化 表面效应：酶促反应在酶的疏水活性中心进行，防止水化膜的形成酶促反应的特性1、具有化学催化剂的特点4、特异性5、调节性2、酶促反应的条件温和：一般最佳反应条件；常温、37°C、pH近中性3、高效性——显著降低活化能C、对于可逆反应，只加快进程而不改变化学平衡常数B、只催化热力学允许的化学反应A、参与反应而无质量变化a、绝对特异性：酶只能作用于特定结构的底物分子，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物c、立体异构特异性：当底物具有立体异构体时，仅用于底物的一种立体异构体b、相对特异性：酶作用于一类化合物或一种化学键d、酶含量的调节e、同工酶：c、共价修饰调节b、酶的别构调节：对酶催化活性a、酶原与酶原激活：生理意义机体的自我保护酶原被视为酶的贮存方式一种调节方式，即当一种同工酶受抑制或破坏时，其他同工酶仍起作用。
第四章 酶法分析
2.专一性不可逆抑制
此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需 基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。有机 磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸 残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。当胆碱 酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分 解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以 乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态， 引起神经中毒症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫 剂结合，使酶和有机磷杀虫剂分离而复活。
(二)可逆性抑制(reversible inhibition)
抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物 理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑 制剂与酶的结合是可逆的。
1.竞争性抑制(competitive inhibition)
(1)含义和反应式
抑制剂I和底物S结构相似，抑制剂I和 底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相 排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结 合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能 再结合S。
为解释酶被底物饱和现象，Michaelis和Menten 做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据， 提出了酶促反应的动力学方程：
SE
S
Et ES
k1 k 1
ES
ES
k2 P E
[ES]生成速度： v1
k1 Et ESS ，[ES]分解速度： v2 k1ES k2 ES
一. 酶浓度的影响
在一定温度和pH下，酶 促反应在底物浓度大于 100 Km时，速度与酶的浓 度呈正比。 酶浓度对速度的影响机 理：酶浓度增加，[ES]也 增加，而V=k3[ES]，故反 应速度增加。
二. 温度对酶促反应速度的影响
酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应 速度加快。化学反应中温度每增加10℃反应速度增加的 倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应的Q10为2～3，而 酶促反应的Q10为1～2。
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生化作用： 组成α-酮酸氧化脱羧酶的辅酶
硫 胺 素
N
焦磷酸硫胺素（TPP）
NH2 CH2— N +
S
CH3
O OH CH2 CH2—
N
CH3
13
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维生素B2
（一）来源： 酵母、蛋、奶及绿叶蔬菜 （二）化学本质： 维生素B2是核醇与 6，7-二甲基异 咯嗪的缩合物。 呈黄色针状结晶，易溶 于水,又叫核黄素。
N 8
NADPH+H+ NADP+
7 6
（7，8） （5，6，7，8） NADPH+H+ NADP+
7 6 7 6
5 N
5 N
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32
维生素B12
(一）来源 动物性食品：肉类、肝 （二）化学本质： 又叫钴胺素,是唯一含有金属元素的维生 素。 天然存在的B12有 5’-脱氧腺苷钴 胺素、甲基钴胺素和羟钴胺素三种形式
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H N 2 2 N 3
N 1
N 8 7 9 CH 2 10 NH
6
4 OH 5 N
CO
谷氨酸
蝶呤啶
对氨基苯甲酸
叶酸
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生化作用： FH4是一碳单位转移酶的辅酶，起着 传递“一碳单位”的作用 叶酸
N 8 5 N
FH2还原酶
二氢叶酸
N 8
FH2还原酶
四氢叶酸
• •
绝大多数的酶都是蛋白质。 少数是以核酸为主要结构的酶，又称核酶。
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2
酶的研究历史
1878年德国科学家Hans Buchner和Eduard Buchner 成 功地用不含细胞的酵母提取液实现了发酵；
1926年美国生化学家Sumner第一次从刀豆分离到脲酶结
晶，提出酶是蛋白质； 1978年发现限制性核酸内切酶； 1989年Altman 和Cech证实RNA有催化功能； 1949年日本采用深层培养法生产细菌—淀粉酶，开辟了
异咯嗪
A
P P 核糖 AMP 腺苷酸
核醇
FMN 黄素单核苷酸
FAD 黄素腺嘌呤二核苷酸
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维生素PP
（一）来源 肉类、肝脏、谷物、花生。此外，人体 可利用色氨酸合成维生素PP 。 （二）化学本质 又叫抗癩皮病因子，它包括尼克酸 （烟酸）和尼克酰胺（烟酰胺），二者均为 吡啶衍生物 （三）缺乏症 糙皮病或癩皮病 表现：皮炎、腹泻、痴呆等症狀
（三）缺乏症 巨幼红细胞性贫血
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核苷酸
核糖
钴 含唯 胺 有一 素 金含 。 属有 钴金 （属 Co元 素 ）的 ，维 故生 又素 2018/10/21 称，
P
碱基
CO+与N的配位键
CO+
R
咕啉环的平面
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钴胺素
R= -CN 氰钴胺素 -OH 羟钴胺素 -CH3－ 甲基钴胺素 -dA 5’脱氧腺苷钴胺素
药用Vit B12 钴胺素的运输形式 甲基转移酶的辅酶 变位酶的辅酶
生化作用： 构成甲基转移酶的辅酶，与FH4一起传递 甲基，起着递甲基的作用。
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简 式
生化作用： 硫辛酸是二氢硫辛酸乙酰转移酶 的辅酶，成为酰基的载体。 SH S +2H L L -2H SH S
氧化型 还原型
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脂溶性维生素:
VitA、VitD、VitE和VitK
分类 水溶性维生素:
VitC
VitB1， VitB2， VitPP， VitB6， VitB12， 泛酸， 生物素， 11 叶酸
B族维源 种子的外皮和胚芽、黄豆、酵母及瘦肉 （二）化学本质 又叫抗脚气病维生素，因其分子中含有硫和 氨基，所以又叫硫胺素。 （三）缺乏症 1、脚气病：四肢无力，肌肉麻木、感觉异 常等末梢神经炎表现。 2、消化不良：胃肠蠕动减慢、消化液分泌 减少，食欲不振。 2018/10/21 12 3、末梢神经炎
（三）缺乏病：
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舌炎、口角炎及眼结膜炎等
14
O
N
核 黄 素
H3C H3C N HCH
N O
N
异咯嗪
核醇
(HCOH)3 CH2OH
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15
单核苷酸
碱基
O P 核 糖
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16
O
生化作用： N N H3C 氧化还原酶的辅酶，起递氢体作用
H3C O
N
N
8
• 概述 维生素特点： 不参与机体构成； 不是能源物质； 需要量少； 缺乏时产生缺乏症——危害很大； 主要以辅酶形式广泛参与体内代谢；（水溶 性维生素） 过量——中毒症。（脂溶性维生素）
2018/10/21 9
维生素可按其溶解性的不同分为脂溶
性维生素和水溶性维生素两大类。 脂溶性维生素有 VitA 、 VitD 、 VitE 和 VitK四种。 水溶性维生素有 B 族维生素 (VitB1 ， VitB2，VitPP，VitB6，VitB12，泛酸， 生物素，叶酸)和VitC
P
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20
生化作用： 多种脱氢酶的辅酶，在氧化还原反应 中起递氢、递电子体作用
NAD+ NADP+ 氧化型
H 2H=H++H++e+e
H
H
H
H++H++e+e
N R
NADH NADPH 还原型
CONH2
CONH2 N+
R
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+H +
e
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维生素B6
（一）来源 动、植物性食品。肠道细菌也可以合成部 分维生素B6。 （二）化学本质 包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺三 者均为吡啶 衍生物 （五）缺乏症 1.γ-氨基丁酸合成障碍，出现过度兴奋，过 敏甚至惊厥等疾病。 2.低血色素小细胞性贫血和血清铁增多。 2018/10/21 22 3.长期服用异烟肼需补充维生素B6。
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3’
生化作用： 酰基转移酶的辅酶，参与三羧酸循环、 4’-磷酸泛酰巯基乙胺成为酰基载体蛋白 脂肪酸氧化及合成等反应 (ACP)的辅基，参与脂肪酸的合成代谢.
4’-磷酸泛酰 巯基乙胺 SH
酰基
辅酶A
运载酰基
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生物素（biotin）
（一）来源： 动物、植物性食品，肠道细菌也可以合 成 （二）化学本质： 是噻吩与尿素相结合的骈环化合物，带有一戊 酸侧链，有α ,β 两种异构体。 （三）缺乏症： 大量服用抗生素或长期食用生鸡蛋可导致生物 素缺乏病，出现疲乏、恶心、呕吐、食欲不振、 皮炎及脱屑性红皮病等症状 2018/10/21 28
产物所需的酶量为一个国际单位（IU）。
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每秒钟
1mol
1催量(kat)
39
1IU=16.67×10-9 Kat; 1Kat=6 ×107IU
酶的比活性(specific activity) :
每毫克蛋白质中含有的酶单位数(U/㎎)。 比活性＝活性U/mg蛋白 ＝总活力性/总蛋白数mg 代表酶的纯度:比活性愈大,纯度愈高
合成酶类：催化由ATP提供能量、两种或两 种以上物质合成一种物质的反应的酶 A + B + ATP = AB + ADP + Pi
44
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国际生化协会（IUB）酶学委员会
（EC）将每一大类酶分为几个亚类，每 一亚类又分为几个亚亚类，最后，再把 属于每一个亚亚类的各种酶按顺序排好， 分别给一个编号排成的一个表称为“酶 表”。
维生素的名称，辅酶形式及其生化功能！
P 59 表4-1
2018/10/21 6
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7
第七节 维生素与辅酶
维生素(vitamin)是人类必需的一类营养素，是 维持机体正常生理功能所必需的，机体自身 又不能合成或合成量不足，必需靠外界供给 的一类微量低分子有机化合物 。
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第四章 酶与维生素 Enzyme and Vitamin
酶的分子结构与功能 酶的命名与分类 酶促反应的特点与机制 酶动力学 酶活性调节 酶与生物医学的关系(自学) 维生素和辅酶
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一、酶的概念 酶是由生物活细胞产生的具有高效催化功 能和高度专一性的有机生物大分子，又叫生物 催化剂。
R HO CH2OH
H3C
N
吡哆醛：R= -CHO 吡哆胺：R= -CH2NH2 吡哆醇：R= -CH2OH
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生化作用： 氨基酸转氨酶及脱羧酶的辅酶
ATP CH2OH ADP
吡哆醛激酶
CH2O
吡哆醛
磷酸吡哆醛
氨基酸代谢
互 变
CH2O
磷酸吡哆胺
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泛
硫辛酸
二氢硫辛酸
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二 酶的活性中心
酶分子中存在的一个特殊空间结构区域，它 与酶催化反应关系密切的氨 直接参与底物的结合和催化反应，这个空 基酸侧链基团 ---必需基团 间区域 称为酶的活性中心。
按照部位分
活性中心的必需基团
活性中心外的必需基团
按照功能分
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结合基团 催化基团
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乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27