生物化学实验 氨基酸的纸层析法

实验氨基酸的纸层析法

一、目的

了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

二、原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器

1、新华滤纸

2、层析缸

3、细线

4、点样管

5、橡皮筋

6、电吹风

7、喷雾器

四、实验试剂

1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液

2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

五、试验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。

2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不

宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。

5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）

六、实验结果

1.标准氨基酸单向上行层析法

定性、定量测定：

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

甘氨酸层析点中心到原点的距离：0.4cm

苯丙氨酸层析点中心到原点的距离：3.2cm

原点到溶剂前沿的距离:10.8cm

在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037

Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296

实验图像：

七、实验分析

由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

注意事项：

1. 在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。防止扩散面积过大，使展层效果不佳或直接影响实验结果。否则分离不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”的现象, 防止氨基酸斑点重叠。

2. 注意点样线要高于层析液面。防止点样氨基酸溶解于层析液中。滤纸不要贴在层析缸璧上。防止滤纸左右两端展层速度过快，影响实验结果。

3. 均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

4．取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸。并尽可能少接触滤纸。在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点.要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在试验台上，以防止污染。

5.展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。

6.在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。

7.展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。

8.风温度不宜过高，否则斑点变黄。

9.影响Rf值的因素有：

①物质本身的化学结构；

②展层所用溶剂系统；

③展层剂pH值；

④展层时的温度；

⑤展层所用滤纸；

⑥展层的方向(横向，上行或下行)。