流式细胞术在微小残留(MRD)检测
【儿科PPT课件】流式细胞术在微小残留(MRD)检测中的应用
4、流式细胞术：根据白血病细胞表面或细胞
内免疫分子来区别并计数白血病细胞。可以 直接计数白血病细胞（ PCR 是根据扩增产物 的量进行推算），并可区分活细胞或将要凋 亡 的 细 胞 及 碎 片 。 敏 感 性 10-4 ， 较 PCR 低 （但达到临床要求）；白血病进展及治疗后， 免疫表型可能发生改变，造成假阴性。目前 仍是最简单、直接、精确、使用的方法。
预报复发；指导缓解后治疗；指导干细胞移
植（时机的把握、术后的监测）；判断预后 和指导更精确的缓解标准。
三、 常用MRD检测方法原理及其优、 缺点：
1、 传统的细胞遗传学：80%--90%的急性
及95%以上的慢性儿童白血病有染色体的异 常改变，如慢粒的PH染色体，这一特征可作 为MRD检测指标。覆盖面广，但敏感性差 （1%--10%）。尤其当基因改变不足以影响 染色体大体水平时会成假阴性。
Hale Waihona Puke TdT/CD10/CD34/CD19抗体组合
流式细胞术在微小残留（MRD） 检测中的应用
一、MRD概念
指白血病患者经诱导治疗达临床缓解后，体
内残存的少量白血病细胞。此时白血病细胞 仍可达 1010 ，是复发的根源。研究表明当体 内白血病细胞小于106时，肌体通过自身免疫 机制可将之清除。即MRD检测敏感性应达到 10-4，才有意义。
二、MRD检测意义
3 、时机选择：常在化疗第 19 天取第一次标
本进行检测。此时白血病细胞及正常重建的 细胞都存在；经过化疗后白血病细胞免疫表 型可能发生改变，而此时已经经过一轮强烈 化疗，今后再变的可能性较小；此时白血病 细胞和正常重建细胞在流式图上的分布特点 就是今后区分白血病细胞与正常细胞的依据。
流式细胞仪检测儿童急性髓系白血病微小残留病的研究进展
ｄｅｒ
Ｖｅｌｄｅｎ等¨６。应用ＦＣＭ对９４例ＡＭＬ儿童进行微小
残留病连续监测。结果表明，初次诱导化疗后的微小残留病 水平可以预测临床长期结果：微小残留病阴性组（微小残留 病＜０．１％），微小残留病弱阳性组（０．１％≤微小残留病 ＜０．５％）和微小残留病强阳性组（微小残留病≥０．５％）的 ３年无复发生存率分别为（８５±８）％，（６４±１０）％和（１４± ９）％（Ｐ＜０．００１）；相应的总体生存率分别为（９５±５）％， （７０±１０）％和（４０±１３）％（Ｐ＜０．００１）。在包括年龄、细胞 核型、ＦＭＳ样酪氨酸激酶３（ＦＬＴ３）基因内部串联重复（ＩＴＤ） 突变和初诊时白细胞计数在内的多因素分析表明，初次化疗 结束后的微小残留病水平是独立的预后因素。 本研究组采用四色ＦＣＭ的方法，对５５例初诊时具有异 常免疫表型的非Ｍ３型ＡＭＬ患儿的骨髓标本进行微小残留 病监测旧…。根据初次诱导（柔红霉素＋阿糖胞苷＋依托泊 苷，ＤＡＥ）化疗后的微小残留病水平，可将患者分成低风险 组（微小残留病＜０．２５％）和高风险组（微小残留病≥ ０．２５％），其５年累积复发率分别为２１．２％和６６．８％（Ｐ＝ ０．００２）。在多因素分析中，初次诱导化疗后的微小残留病水 平是其他所有研究参数（包括年龄、细胞遗传学状态、初诊白
主堡』Ｌ型苤查！！！ｊ生ｊ旦笠ｉ！鲞箜！塑￡地！』里！ｉ堕！：丛！堕！垫！！：∑！！：ｉ！：塑垒！
・２３１・
．综述．流式细胞仪检测儿来自急性髓系白血病微小残留病的 研究进展
冯建华徐晓军 汤永民
ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）发病率 ＦＣＭ检测微小残留病的优点是能够准确定量残留白血 病细胞。另外，ＦＣＭ可以区分存活和凋亡细胞，并有助于了 解标本中正常造血细胞状态的概况。ＦＣＭ检测微小残留病 存在的一个问题是ＬＡＩＰ表达模式的不稳定性。研究表明， 相当高比例的ＡＭＬ患者的抗原表达模式会在疾病过程中发 生转变，即“抗原漂移”。２０“ｏ。对于医疗资源以及技术有限 的国家或地区，可以采用三色或四色ＦＣＭ集中于治疗早期 （例如诱导治疗中期；初次诱导后）检测微小残留病，从而降 低检测成本，同时可以避免因治疗后期（例如巩固治疗后） 抗原漂移或再生骨髓中正常幼稚细胞干扰而造成假阴性或 假阳性结果。然而上述操作却不利于长程随访监测。此外， 治疗早期的微小残留病水平比较适合反映“白血病细胞清 除速度”，其代表白血病细胞对化疗的敏感程度，而目前尚无 公开资料支持“快速的白血病细胞清除”与获得微小残留病 阴性结果之间存在联系嵋”…。因此用于微小残留病检测的 抗体组合不应局限于初诊时检测到的一种免疫表型，同时也 应该包括所有检测时间点的多种抗体组合Ⅲ‘２“。理论上， 所采用的每组免疫学标志物即抗体数目越多，则识别白血病 细胞的特异性就越高。有研究表明，采用６色ＦＣＭ技术分 析不仅可以提高检测敏感度，同时也可因ＬＡＩＰ组合的优化 而改善白细胞克隆定性信息的质量‘２“。采用每组８色的 ＬＡＩＰ表型，则识别白血病细胞的特异性更高，目前已经开始 采用８色ＦＣＭ进行微小残留病的监测。然而，若每组表型 使用的标记数过多，则ＦＣＭ的检测成本将超过ＰＣＲ，因此已 有研究使用标准或特异性的个体化抗体组合用于检测微小 残留病。此外，ＦＣＭ检测微小残留病的质量具有一定程度 的操作者依赖性，需要娴熟的流式细胞术分析专业技术予以 保证。为得到可靠结果，检测过程、试剂、分析必须标准化， 包括开发流式细胞数据自动分析软件’２５，同时需要各个实 验室之间的对照研究，特别是多中心研究。 二、ＦＣＭ检测微小残留病的临床应用 １．临床预后和治疗指导意义：近年来的研究证实，骨髓 中白血病细胞的动态消减和微小残留病水平可用于判断预 后、评估复发风险。Ｓｉｅｖｅｒｓ等¨４ Ｊ的回顾性研究采用标准三
急性髓系白血病微小残留病检测与临床解读
和NGS等方法在患者体内检测不到白血病细胞；部分MRD阴性患者可再 次转为MRD阳性导致晚期复发；部分患者获得临床治愈（图1）。
二、MRD的概念和检测方法
（二）分子学方法检测MRD
2．分子标志检测MRD的技术要求： 应用1 μg RNA逆转录为cDNA，每次反应的cDNA相当于100 ng RNA（约
为200 000个细胞，如果基因表达水平高则需要的细胞数量少）。 对于基于DNA的方法，每次反应需要至少100 ng DNA（约为15 000个细
此外，包括RUNX1、GATA2、CEBPA、DDX41和ANKRD26在内的某些 胚系基因突变与AML发生风险相关，如果把这些基因突变作为MRD评估 的标志，就需要应用DNA测序的方法除外它们是胚系组织（皮肤组织、 毛囊或颊黏膜）来源的突变。
多个MRD分子标志物组合应用可克服单个分子标志物评估MRD的缺陷， 该缺陷包括AML亚克隆的异质性和CHIP的存在对MRD的影响等。
二、MRD的概念和检测方法
二、MRD的概念和检测方法
二、MRD的概念和检测方法
（一）MFC检测MRD
用于MFC评估表型异常白血病细胞的单克隆免疫荧光抗体包括CD34、 CD117、CD13和CD33，跨系表达抗原CD2、CD7、CD19和CD56等。
利用MFC检测MRD的方法包括白血病相关异常表型（LAIP）以及与正常 骨髓细胞表型相鉴别（D-F-N，different from normal），前者是指初诊时 确定患者的LAIP，在随后的治疗过程中利用LAIP进行MRD检测；后者可 用于缺乏初诊LAIP的患者，也可检测治疗过程中出现的抗原漂移 （Antigen shift）。
MRD动态监测简介演示
05
MRD动态监测的未来展望
提高灵敏度和特异性
灵敏度
通过改进检测技术和优化实验流 程，提高MRD动态监测对微小残 留病灶的检测能力，降低假阴性 率。
特异性
加强对MRD动态监测的特异性研 究，降低假阳性率，提高监测结 果的可靠性。
实现标准化和个性化
标准化
制定统一的MRD动态监测标准和操 作规范，确保不同实验室之间的结果 具有可比性，促进临床研究的交流与 合作。
02
MRD动态监测技术
流式细胞术
流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速、多参数 分析的技术。在MRD动态监测中，流式细胞术可用于检测和 计数微小残留病灶，从而评估治疗效果和预测复发风险。
流式细胞术的优点包括速度快、通量高、可同时检测多个参 数，适用于大规模样本的快速分析。然而，流式细胞术的灵 敏度和特异性受到抗体选择和细胞异质性的影响，可能导致 假阳性或假阴性的结果。
02
MRD的检测方法通常是通过特定 的分子或细胞检测技术，对肿瘤 细胞进行灵敏度极高的检测。
MRD动态监测的意义
01
02
03
早期发现肿瘤复发
通过对MRD的动态监测， 可以在肿瘤复发早期发现 ，从而及时采取治疗措施 ，提高治愈率。
评估治疗效果
通过监测治疗前后MRD的 变化，可以评估治疗效果 ，为调整治疗方案提供依 据。
MRD动态监测简介演示
汇报人： 2024-01-09
目录
• MRD动态监测概述 • MRD动态监测技术 • MRD动态监测在血液肿瘤中
的应用 • MRD动态监测在实体瘤中的
应用 • MRD动态监测的未来展望
01
MRD动态监测概述
MRD定义
微小残留病灶(MRD)监测在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的应用进展
微小残留病灶(MRD)监测在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的应用进展任雨虹【摘要】慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是西方国家最常见的成人白血病,在我国的发病率也日益增加.近年来针对CLL的新药层出不穷,微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)监测逐渐成为评估疗效的重要手段.本文总结了目前常用的MRD检测方法,包括流式细胞学和基于PCR法的分子学检测,并介绍了其在初治CLL疗效评价、预后评估和在移植后CLL复发预警方面的应用进展.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2019(046)003【总页数】5页(P404-407,419)【关键词】慢性淋巴细胞白血病(CLL);微小残留病灶(MRD);监测【作者】任雨虹【作者单位】复旦大学附属中山医院血液科上海 200032【正文语种】中文【中图分类】R733.72慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤,以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征,在西方国家的年发病率为4.2/10万,80岁以上人群年发病率甚至超过30/10万[1]。
CLL的治疗方案经历了从传统化疗到化学免疫治疗的转变,但CLL的首要治疗目标仍是获得更深程度的缓解和更持久的无进展生存(progression free survival,PFS)。
能达到更深检测程度的微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)监测逐渐成为了疗效评估的重要指标。
不同于其他白血病,CLL预后的高度异质性和累及多部位的特点使得针对其MRD的监测比其他白血病更复杂。
本文将对目前MRD监测在CLL中的应用进展进行介绍。
MRD在CLL中的检测方法作为一项评估疗效深度的监测指标,理想的MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。
白血病微小残留检测及其质量控制(流式细胞术)
2. 流式细胞术是直接进行定量，更为精确；而PCR是根据 产物的量进行推算。
3. 流式细胞术检测时可以区别活细胞和经化疗将要死亡的 细胞以及死亡细胞的碎片（而这些死亡的细胞以及细胞 碎片在PCR检测中都可能形成阳性信号）。
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Fluorescent Standard
Obtain Results
Troubleshoot Maintenance
Color Compensation
Generate Report
FAIL
Process/ Method Control
PASS
Test Reimbursement
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Elaine Coustan-Smith, etal. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2000, 96(8):2691-2696
流式细胞术检测白血病MRD原理
利用抗原表达的差异，以直观的方式区分白血病 细胞和正常的骨髓细胞（正常生理状态下和骨髓重建期）
跨系表达的抗原 质的差异 时相混乱的抗原 与染色体异常相关的抗原 抗原表达量异常高 量的差异 抗原表达量异常低
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
差异
流式细胞术质量控制
流式细胞术质量控制流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。
由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。
同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。
作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。
在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。
分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。
为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。
它包括质量保证、质量控制和质量评估。
质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。
主要利用质量控制和质量评估。
质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。
对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。
质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。
当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。
因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。
FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。
目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。
2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。
白血病微小残留病的检测方法及其意义
白血病微小残留病的检测方法及其意义蒋惠【摘要】目的:研究微小残留病(MRD)的检测在白血病复发预测以及临床治疗指导方面的意义.方法:选取40例白血病患者标本,通过多参数流式细胞术(FCM)检测MRD,从诱导化疗治疗后的第21天开始,每个月检测一次.按照首次接受诱导治疗后的第21天检测的MRD水平,将40例AL分为低(MRD＜ 10-4)、中(MRD:0.01 ～ 10-4)、高(MRD＞0.01)三个组.结果:低、中、高三组三年的复发率分别为0、20.0％、85.71％.其中MRD ＞0.01组3年复发率最高,MRD＜ 10-4组预后好,两组复发率的差异有统计学意义(P＜0.05).在随后MRD动态监测的过程中,形态学完全缓解时的MRD阳性组与阴性组的复发概率具有明显差异(P＜0.05).结论:MRD ＞0.01提示复发具有高概率,MRD阳性比形态学复发出现早,连续的MRD监测对于个体化治疗以及预测复发具有重要的临床应用意义.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2012(021)002【总页数】2页(P18,20)【关键词】白血病;微小残留病;免疫表型分析【作者】蒋惠【作者单位】四川省凉山州第二人民医院检验科,四川凉山615000【正文语种】中文【中图分类】R733.7微小残留病 (MRD)指的是白血病患者经过骨髓移植治疗或者诱导化疗获得完全缓解，体内残有的少量白血病细胞的一种状态［1］。
为了能够提前的预测白血病的复发，以及指导临床用药或骨髓抑制效果，目前出现了流式细胞术 (FCM)检测微小残留病 (MRD)的试验。
本研究跟踪40例急性白血病病人的140例骨髓标本进行微小残留病的动态监测分析，证明微小残留病在急性白血病复发的预测中有重要的临床指导意义。
1 资料与方法1.1 一般资料选取2008年8月至2010年1月缓解后急性白血病患者40例，男22例，女18例，年龄27～73岁，平均年龄为50岁，共140份骨髓标本，进行MRD检测。
儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的流式细胞术检测分析
ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｒ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｎ ｏ ｒ ｌ Ｔ ｌ ａ ］ｂ ｏ ｎ ｅ ｍａ ｌ Ｔ Ｏ Ｗ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ Ｍ ＲＤ．Ｔ ｈ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｍｏ ｎ ｉ ｔ ｏ ｒ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ａ ｎ ｅ ｌ ｉ ｎ １ ０ ５ ｃ ａ ｓ ｅ ｓ ｏ ｆ ｃ ｈ ｉ ｌ ｄ ｒ ｅ ｎ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｅ ｎ ｄ ｏ ｆ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ｐ ｙ ａ ｎ ｄ ｆ ｏ ｌ ｌ ｏ ｗ ｕ ｐ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ．Ｃ ｙ ｔ ｏ ｍｏ ｒ — ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ Ｐ ＣＲ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｍ ｅ ｒ ｄ ｓ ｉ ｍｕ ｌ ｔ ａ ｎ ｅ ｏ ｕ ｓ ｌ ｙ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｆ ｌ ｏ ｗ ｃ ｙ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｏ ｕ ｔ ４ ６ ２ ｃ ａ ｓ ｅ ｓ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ — ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｔ ｏ Ｍ ＲＤ． ＰＣ Ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｏ ｕ ｔ １ ４ ２ ｃ ａ ｓ ｅ ｓ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｒ Ｉ ｇ Ｈ／ Ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ｅ ａ ｒ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ｍｅ ｎ ｔ
态 学对诱 导 治 疗 后 的患儿 的 ＭＲ Ｄ阳性 检 出率 为 ６ ６ ． ６ ７ ％，流式 细胞 术 的 ＭＲ Ｄ阳性 检 出率 为 ９ １ ． ４ ３ ％治 疗期 间 的 ＭＲ Ｄ作 出准 确评估 ， 具 有较 好 的覆 盖面 和敏感 性 ， 值 得临床 应用 。 ｆ 关键词】急 性淋 巴细胞 白血 病 ； 微 小残 留病 ； 流 式细胞 术
急性髓系白血病AML-MRD的监测(流式细胞术)
MICM分型（WHO-2008）
AML的预后
AML的预后
微小残留病的定义
1
微小残留病与预后
MICM与微小残留病
MICM与微小残留病
MICM与微小残留病
理想的MRD监测方法
免疫分型—流式细胞术
2
免疫分型—流式细胞术
免疫分型—流式细胞术
免疫分型—流式细胞术
流式检测微小残留病
流式检测微小残留病
3
白血病免疫表型的检出特异性 白血病免疫表型的检出特异性
BLOOD, 15 NOVEMBER 2004 VOLUME 104, NUMBER 10
4
白血病免疫表型的检出频率
5
白血病免疫表型的检出频率
白血病免疫表型检出的敏感性
白血病免疫表型检出的稳定性
6
微小残留病与预后
微小残留病与预后
MRD对AML患者5年RFS和OS的影响
MRD对AML患者5年RFS和OS的影响
7
MRD监测方法的选择
MRDM监R测D监中测应注意的问题
MRDM监R测D监中测应注意的问题
MRD监测方法的选择
MRD监测中应注意题
MRD监M测R指D导监临测床的重要意义
MRD监测实例分析 解放军总医院血液科
AML-MRD检测 病例分析5例
未来的目标
今后的挑战
9
流式细胞技术在急性髓系白血病微小残留病检测中的应用
的治 疗干 预 ， 对患 者 缓 解 后 的 治疗 有 着 更 加 实 际 的
意 义 。
传 统 形态 学 分 类 是 最 基 本 的 ＭＲ Ｄ监测方法 ， 但 其敏 感 度 较低 ， 仅为 １ ０ ＿ 。 ， 临 床 上 用 来 评 价 疗 效 及 提示 预后 的意义 有 限 。近年 来 大量 关 于 ＭＲ Ｄ 监
高检 出率 ， 但 是也 只 适 用 于 有 特 殊 遗传 学 改 变 的患 者 。Ｐ Ｃ Ｒ技术操作简便 ， 敏感性 高， 分 辨 率 一 般 可 以达 到 １ Ｏ ～１ Ｏ 一， 但 假 阳性 率 也 高 ， 只适 用 于 有 特殊 遗传 学改 变 的患 者 。对 于没有 特殊 遗传 学 特点
第 ３ ６卷 第 ２期 ２ ０ １ ３年 ２ 月
新 疆 医 科 大 学 学 报 Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｘｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Ｖｏ １ ． ３ ６ ＮＯ ． ２
Ｆｅ ｂ． ２０１ ３
・
综述 ・
流式细胞技术在急性 髓系 白血病微小残 留病 检测 中的应用
李 元 媛 综述 王 慧君 ，秘 营 昌 审校
３ ０ ０ ０ ２ ０ ）
（ 中 国 医 学科 学 院 血 液 病 医 院 血 液 学 研究 所 ，天 津
中 图分 类 号 ： Ｒ ７ ３ ３ ． ７
文献标识码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ９ — ５ ５ ５ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ ０ ２ ５ ５ — ０ ４
急性髓 系 白血病 （ ＡＭＬ ） 占急 性 白血 病 的 ６ ０
～
适 用 于 大 多 数 急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 患 者 和 超 过 ８ Ｏ 的 ＡＭＬ病 例 。在 ＡＭＬ患者 ＭＲＤ监 测 中应 用 越来 越广 ； 既 可 以单 独应 用 ， 在有 特殊 分子标 志 的 患 者还 可 以与 Ｐ Ｃ Ｒ技术 联合 。可 以单 独 根据 ＭＦ Ｃ 监测 ＭＲ Ｄ 的结 果 判 断 ＡＭＬ患 者 的疗 效 ， 也可 以 将 ＭＦ Ｃ监测结 果 与遗 传 学指 标 结合 对 患 者进 行 预
列出mrd检测方法(一)
列出mrd检测方法(一)MRD检测方法MRD（Minimal Residual Disease）是指在治疗后仍残留在患者体内的极小数量的癌细胞或其他致病微生物。
准确检测MRD对于判断患者的治疗反应和预后具有重要意义。
以下是一些常用的MRD检测方法：流式细胞术（Flow Cytometry）•流式细胞术是一种基于免疫荧光标记的技术，用于检测细胞表面标记物。
•通过在血液或骨髓细胞中使用特定的抗体标记淋巴细胞亚群或白血病细胞，并通过仪器测量它们的荧光强度来判断是否存在MRD。
•优势：高灵敏度，可以同时检测多个标记物。
•缺点：不能准确区分MRD来源于异常克隆细胞还是正常克隆细胞。
定量聚合酶链反应（qPCR）•定量聚合酶链反应是一种可以检测特定DNA序列的方法。
•通过使用合适的引物和荧光探针，对靶DNA进行扩增，并测定荧光信号来定量目标序列。
•优势：高灵敏度，可以定量测定MRD的数量。
•缺点：需要已知的特异性引物和标准品，适用于特定的疾病类型。
基于DNA测序的方法•基于高通量测序的方法对MRD的检测具有高灵敏度和高分辨率的优势。
•可以通过对患者骨髓或血液中的DNA进行测序，通过比对准确鉴定MRD。
•优势：高灵敏度和高分辨率，可以鉴定MRD的突变谱。
•缺点：设备和技术要求较高。
表面增强拉曼散射光谱（SERS）•表面增强拉曼散射光谱是一种能够检测极小分子浓度的方法。
•通过将样本与纳米结构表面接触，利用拉曼散射光谱的特征峰来检测MRD。
•优势：高灵敏度，可以检测极小数量的MRD。
•缺点：技术要求较高，实验条件较为复杂。
多重肽核酸聚合酶链反应（MPCR）•多重肽核酸聚合酶链反应是一种能够同时检测多个序列的方法。
•通过设计具有高特异性的引物和探针，可以同时检测多个与MRD 相关的序列。
•优势：高通量，可以同时检测多个目标序列。
•缺点：需要已知的特异性引物和标准品。
以上是一些常用的MRD检测方法，每种方法都具有不同的优势和限制。
流式细胞术在骨髓增生异常综合征微小残留病灶检测中的意义
流式细胞术在骨髓增生异常综合征微小残留病灶检测中的意义1.骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)骨髓增生异常综合征是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，其特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）转化[1]。
MDS的流行病学评估受诊断分型和诊断标准发展及肿瘤分类的影响，据美国国立癌症研究所报告，1975-2016年间普通人群的年发病率约为 4.5 /10万，按年龄调整的年发病率约为4.0/10万，随年龄增长发病率明显增加，70 - 79 岁之间的人群中，发病率增加到26.9/10万，而在 80 岁以上的人群中，发病率进一步上升到55.4/10万，男性发病率略高于女性。
MDS的病因尚不明确。
其确切发病机制亦尚未完全阐明，目前研究提示MDS的发生发展是一个多因素、多步骤、连续动态的过程。
因环境、职业或生活中的毒害因素或自发性突变，在易感个体中造成造血干、祖细胞的初始性变故（initiating event）,这种受损的干、祖细胞一方面逐渐对正常干、祖细胞形成生长或活存优势，成为单克隆造血，伴有基因组不稳定性，易于发生继发性细胞遗传学异常。
另一方面诱发免疫反应，导致T细胞介导的自身免疫骨髓抑制，进一步损害造血细胞的增殖和成熟。
持续性自身免疫性攻击诱发单个核细胞和基质细胞过多产生TNF-α、IFN-γ等细胞因子，后者诱发造血细胞过度凋亡，导致无效造血。
MDS的诊断较为困难，基本上是排除性诊断。
尤其是原始细胞比例增高不明显且无克隆性染色体核型异常患者的诊断，需排外其他可导致血细胞减少和发育异常的造血和（或）非造血系统疾病。
对于确诊的MDS，修订的MDS国际预后积分系统（IPSS-R）依据病人血细胞减少的数量、染色体核型及骨髓中原始细胞比例将其分为极低危、低危、中危、高危、极高危五个危险分组。
多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识(完整版)
多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识(完整版)多参数流式细胞术(multiparameter flow cytometry, MP-FCM )是运用不同荧光标记的多种抗体组合对造血细胞表面或胞内抗原的表达状况进行检测，进而对细胞的系列来源、分化程度、表型异常与否进行分析判断的高通量、高敏感性检测技术,其在恶性血液病的诊断分型、治疗监测、预后评估及治疗靶点筛查中已成为必不可少的实验诊断手段［1,2］。
微小残留病(minimal residual disease, MRD )是指恶性血液病经过治疗达到血液学完全缓解后体内残存的通过形态学等传统方法无法检测到的田可水平的微量肿瘤细胞状态⑶4］。
近年来,也有学者根据现有检测技术的局限性将MRD定义为可检测的残留病(measurable residual disease ［运用FCM检测恶性血液病MRD的硏究始于20世纪80年代, 利用2~4色FCM对急性白血病的治疗后样本进行检测,并基于在正常细胞分布之外的”空白"区域检测到异常表型的理论对MRD进行分析鉴别［5,6］;在过去的10年中，随着FCM水平的不断提高，特别是8~10色MP-FCM在MRD检测中体现出敏感性高、特异性好、适用范围广的优势, MRD 的FCM检测从小规模样本的临床硏究发展到大规模样本的临床验证，目前已成为恶性血液病临床疗效判断和预后分层的重要依据，而基于MRD指导下的个体化治疗可以使不同危险度分层组中的患者避免过度治疗或治疗不足,以提高患者的长期生存率［7,8,9］。
然而，由于白血病等恶性血液病存在不同程度的克隆异质性、不同治疗方案对免疫表型和克隆筛选的影响、化疗后不同时间点骨髓造血恢复的状况不一、不同基因背景的残留肿瘤细胞在复发时的增殖动力学不同等疾病自身因素的复杂性，以及不同检测中心在抗体组合、荧光搭配、样本处理、圈门策略、分析逻辑、主观经验、质控管理等诸多技术环节中的差异, 目前国内外对于MRD的检测和分析还缺乏规范化，导致对MRD检测结果的临床解读和预后评估标准存在不一致性。
多参数流式细胞仪检测急性髓细胞白血病微小残留病:挑战与对策
多参数流式细胞仪检测急性髓细胞白血病微小残留病：挑战与对策常英军;赵晓甦【摘要】多参数流式细胞仪(FCM)是急性白血病微小残留病(MRD)检测的重要手段之一,但在检测急性髓细胞白血病(AML) MRD方面还存在诸多问题.本文讨论了FCM检测AML MRD面临的挑战,并提出相应的对策.【期刊名称】《临床荟萃》【年(卷),期】2016(031)006【总页数】4页(P581-584)【关键词】白血病,髓样,急性;微小残留病;流式细胞术【作者】常英军;赵晓甦【作者单位】北京大学人民医院北京大学血液病研究所造血干细胞移植治疗血液病北京市重点实验室,北京100044;北京大学血液协同创新中心,北京100044;北京大学人民医院北京大学血液病研究所造血干细胞移植治疗血液病北京市重点实验室,北京100044【正文语种】中文【中图分类】R733.72常英军，北京大学人民医院、北京大学血液病研究所、北京市造血干细胞移植重点实验室主任医师，教授，硕士研究生导师。
北京大学血液学系副主任，中华医学会血液学分会第九届青年委员会副主任委员，美国免疫学会国际会员，中国病理生理学会实验血液学会委员，中华医学会细胞生物学分会青年委员等。
长期从事恶性血液病诊治及造血干细胞移植临床及基础研究工作。
目前承担“863”项目、国家自然科学基金面上项目、北京市自然科学基金、首都特色项目及国际合作项目等课题。
获国家科技进步二等奖1项，中华医学科技一、二等奖各1项及中国抗癌协会科技二等奖1项。
现为《New England Journal of Medicine》、《Oncotarget》、《J Hematol & Oncol》、《Clinical and Experimental Immunology》、《Immunobiology》、《Annals of Hematology》、《Human Immunolgy》以及《BMC Hematology》等杂志审稿专家；《中华血液学杂志》、《临床荟萃》等杂志编委。
流式细胞术在微小残留(MRD)检测
4、流式细胞术：根据白血病细胞表面或细胞 内免疫分子来区别并计数白血病细胞。可以 直接计数白血病细胞（PCR是根据扩增产物 的量进行推算），并可区分活细胞或将要凋 亡 的 细 胞 及 碎 片 。 敏 感 性 10-4 ， 较 PCR 低 （但达到临床要求）；白血病进展及治疗后，
免疫表型可能发生改变，造成假阴性。目前 仍是最简单、直接、精确、使用的方法。
TDT/CD34/CD10/CD19
65.71%
CD38/CD34CD10/CD19
45.71%
CD58/CD34/CD10/CD19
61.43%
CD45/CD34/CD10/CD19
44.29%
CD66c/CD34/CD10/CD19 32.86%
CD22/CD34/CD10/CD19 合计
2、 荧光原位杂交（FISH）：依靠区域特异 DNA探针对染色体染色来鉴别染色体数量和 结构的改变，从而区分白血病细胞。分子水 平。敏感性差。
3、聚合酶链反应（PCR）：通过检测扩增 的靶系列（染色体断裂点融合区、免役球蛋 白及T细胞受体基因重排）来区分白血病细胞。 敏感性最高10-6 。但覆盖面小（65%儿童 ALL缺乏特异的含有断裂点融合区的染色体 改变；另由于白血病细胞重组酶活性较强， 重排基因可能进一步重排，造成假阴性。）
但据白血病细胞抗原表达特点跨系时相紊乱量的异常及正常早期b细胞对糖皮质激素十分敏感等特点仍能找出相应检测中的应用
一、MRD概念
指白血病患者经诱导治疗达临床缓解后，体 内残存的少量白血病细胞。此时白血病细胞 仍可达1010，是复发的根源。研究表明当体 内白血病细胞小于106时，肌体通过自身免疫 机制可将之清除。即MRD检测敏感性应达到 10-4，才有意义。
列出mrd检测方法
MRD检测方法1. 简介MRD（Minimal Residual Disease，最小残余疾病）是指在治疗过程中仍存在的极低水平的癌细胞或其他病理细胞。
MRD检测是一种用于评估治疗效果和预测复发风险的重要方法。
本文将介绍常见的MRD检测方法及其原理、优缺点以及应用领域。
2. 流式细胞术（Flow Cytometry）原理流式细胞术是一种通过对单个细胞进行标记并通过流式细胞仪进行分析的方法。
在MRD检测中，可以使用免疫荧光染色技术标记特定的抗原，然后通过流式细胞仪对标记的细胞进行计数和分析。
优点•可以实现高通量分析，快速获得结果。
•可以同时检测多个抗原。
•可以精确计算MRD水平。
缺点•对样本质量要求高，需要高质量的单个细胞悬液。
•对操作人员技术要求高，需要专业培训和经验。
•需要昂贵的设备和试剂。
应用领域•白血病等血液系统肿瘤的MRD监测。
•免疫治疗后的效果评估。
3. 定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）原理定量PCR是一种通过扩增目标DNA序列并使用荧光探针实时监测扩增过程的方法。
在MRD检测中，可以设计特异性引物和探针来扩增和检测与肿瘤相关的基因或染色体异常。
优点•可以实现高灵敏度的定量分析。
•可以在不同样本之间进行比较。
•技术成熟，广泛应用。
•需要设计特异性引物和探针，对操作人员技术要求较高。
•对样本质量要求高，需要高质量的DNA。
应用领域•白血病、淋巴瘤等血液系统肿瘤的MRD监测。
•固体肿瘤中某些特定基因突变的监测。
4. 高通量测序（Next-generation Sequencing）原理高通量测序是一种通过对DNA或RNA进行大规模并行测序的方法。
在MRD检测中，可以使用特定的引物扩增目标基因区域，然后通过高通量测序仪进行测序，最后通过比对和分析数据来计算MRD水平。
优点•可以同时检测多个基因或区域。
•可以发现新的基因突变或异常。
•可以提供更全面的信息。
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一、MRD概念
指白血病患者经诱导治疗达临床缓解后，体 内残存的少量白血病细胞。此时白血病细胞 仍可达1010，是复发的根源。研究表明当体 内白血病细胞小于106时，肌体通过自身免疫 机制可将之清除。即MRD检测敏感性应达到 10-4，才有意义。
二、MRD检测意义
4、流式细胞术：根据白血病细胞表面或细胞 内免疫分子来区别并计数白血病细胞。可以 直接计数白血病细胞（PCR是根据扩增产物 的量进行推算），并可区分活细胞或将要凋 亡 的 细 胞 及 碎 片 。 敏 感 性 10-4 ， 较 PCR 低 （但达到临床要求）；白血病进展及治疗后，
免表型可能发生改变，造成假阴性。目前 仍是最简单、直接、精确、使用的方法。
3、时机选择：常在化疗第19天取第一次标 本进行检测。此时白血病细胞及正常重建的 细胞都存在；经过化疗后白血病细胞免疫表 型可能发生改变，而此时已经经过一轮强烈 化疗，今后再变的可能性较小；此时白血病 细胞和正常重建细胞在流式图上的分布特点 就是今后区分白血病细胞与正常细胞的依据。
4、常用抗体组合及其有效频率：
12.86% 91.43%
TdT/CD10/CD34/CD19抗体组合
2、 荧光原位杂交（FISH）：依靠区域特异 DNA探针对染色体染色来鉴别染色体数量和 结构的改变，从而区分白血病细胞。分子水 平。敏感性差。
3、聚合酶链反应（PCR）：通过检测扩增 的靶系列（染色体断裂点融合区、免役球蛋 白及T细胞受体基因重排）来区分白血病细胞。 敏感性最高10-6 。但覆盖面小（65%儿童 ALL缺乏特异的含有断裂点融合区的染色体 改变；另由于白血病细胞重组酶活性较强， 重排基因可能进一步重排，造成假阴性。）
预报复发；指导缓解后治疗；指导干细胞移 植（时机的把握、术后的监测）；判断预后 和指导更精确的缓解标准。
三、 常用MRD检测方法原理及其优、 缺点：
1、 传统的细胞遗传学：80%--90%的急性 及95%以上的慢性儿童白血病有染色体的异 常改变，如慢粒的PH染色体，这一特征可作 为MRD检测指标。覆盖面广，但敏感性差 （1%--10%）。尤其当基因改变不足以影响 染色体大体水平时会成假阴性。
TDT/CD34/CD10/CD19
65.71%
CD38/CD34CD10/CD19
45.71%
CD58/CD34/CD10/CD19
61.43%
CD45/CD34/CD10/CD19
44.29%
CD66c/CD34/CD10/CD19 32.86%
CD22/CD34/CD10/CD19 合计
四、以ALL为例流式细胞术在MRD检 测中的具体应用
1、原理
2、指标的选择：理想的指标是只在白血病 细胞表达而不在正常细胞表达的抗原。尚未 发现。但据白血病细胞抗原表达特点（跨系、 时相紊乱、量的异常），及正常早期B细胞对 糖皮质激素十分敏感等特点，仍能找出相应 指标。常为几种抗原的组合。如 CD34+/CD10+/CD19+