western blot详细步骤

实验室308蛋白质电泳

2015.04.08-Lenka Chen

1粗酶液提取

取1g鲜样，加2mL提取缓冲液[含Hepes100mmol/L（pH7.4），EDTA2mmol/L，甘油12.5％（V/V），MgCl28mmol/L，巯基乙醇50mmol/L]，放置冰上研钵，研磨至匀浆，4℃下20000 r/min离心10min，取上清；用2mL提取缓冲液重悬沉淀，12000r/min离心5min，将上清合并，作为备用粗酶液。

2总蛋白含量的测定（Bradford法）

1）标准曲线的制作

取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度绘制标准曲线。

表2-1各试管中试剂加入量

Table2-1The content added into each test tube

试剂

试管

012345

标准蛋白(mL)00.20.40.60.8 1.0

蒸馏水(mL) 1.00.80.60.40.20

考马斯亮蓝试剂(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

蛋白质含量(μg)020*********

2）吸取1.0ml蛋白质样品加入5mL考马斯亮蓝试剂，混合摇匀，2min后用分光光度计测量595nm下蛋白质吸收值。根据标准曲线计算待测样品的浓度：

蛋白质含量(mg/g)=C×V T×N/(W×V S×1000)

C：从标准曲线上查得蛋白质的质量，μg

V T：样品提取液总体积，ml

V：显色时取样品液量，ml

W：样品重，g N：稀释倍数

标准(100μg/ml)牛血清蛋白溶液：

称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml用蒸馏水稀释至100ml。

考马斯亮蓝G-250溶液：

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml85%(w/v)的磷酸，再用

蒸馏水定容到1L，过滤置于棕色瓶中保存。

3.配胶

（1）洗净电泳用的玻璃板，晾干，按仪器使用说明装好。

（2）配12％分离胶15mL（3块胶的量）,分别取：

1.5M pH8.8Tris-HCl 3.75mL（分离胶缓冲液）

40％Acryl/Bis 4.5mL，

dd H2O 6.5mL

10％SDS150μL

TEMED15μL（夏季室温高可少加）

10％APS75μL（夏季室温高可少加）现用现配，最后加混匀，灌胶。

（3）灌好分离胶，上面用200μL异丙醇封好。

（4）待分离胶凝固后(凝胶时间半小时左右)，配4％浓缩胶（2.3ml）：

0.5M pH6.8Tris-HCl 1.5mL，（浓缩胶缓冲液）

40％丙烯酰胺2mL，

dd H2O3mL

10％SDS60μL，

TEMED15μL（夏季室温高可少加）

10％APS30μL（夏季室温高可少加）现用现配，最后加混匀。

（5）用双蒸水洗净胶上的异丙醇，灌入浓缩胶，插入梳子，凝固半小时以上。

（6）待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓冲Buffer。

（7）蛋白上清液用15μL2×SDS上样缓冲液悬浮，煮5分钟，12000rpm离心10min，取上清。

（8）按顺序上样，同时上标准相对分子质量的蛋白质样品。

上样量为:Marker（5μL），样品（10μL）

（9）开始电泳时用80V，待样品全部进入胶后增大到120V。

（10）溴酚蓝指示剂电泳到分离胶底部时（距底部1cm左右），停止电泳。

4.电泳转移

（1）切掉无效的浓缩胶。

（2）量好尺寸，按尺寸大小切割硝酸纤维素膜

（3）在转移板上按顺序操作，每一步不能有气泡：

①用转移Buffer浸湿后的海绵片一张（接触转移板黑色部分）

②用转移Buffer浸湿后的滤纸两张

③放上切割好的胶

④胶上放硝酸纤维素膜，正面贴胶

⑤湿滤纸两张

⑥湿海绵片一张（接触转移板白色部分）

（4）合上转移板，放入电泳槽，注意电极胶靠负极。倒入转移缓冲液。以没过三明治夹为准。

（5）插入电极，100mA恒流电泳90min。

（6）转移结束后，取出硝酸纤维素膜。

5.免疫印迹

（1）用TBS缓冲液洗膜10min，在摇床上轻轻摇动。

（2）将膜用封闭溶液封闭，用37℃摇床轻轻摇动2h。

（3）轻轻地转移掉封闭溶液，并用TBS溶液洗膜两次。悬浮洗膜一次，第二次10min。（4）用锡箔纸叠一个稍大于硝酸纤维素膜的盒子，将硝酸纤维素膜正面朝上贴入锡纸盒。（5）将10ml一抗溶液（一抗原液：封闭液＝1：500）倒入锡纸盒。

（6）4℃过夜。

（7）去掉第一抗体溶液，用TTBS洗膜3次，每次10min，置于摇床上轻轻摇动。

（8）按照和一抗同样的操作用二抗溶液孵育硝酸纤维素膜。二抗：抗体稀释液按1：1000稀释（二抗偶联碱性磷酸酶）。

（9）室温结合2h。

（10）用TBST洗3次，每次10min。

（11）用TBS溶液洗膜一次。

（12）显色，NBT/BCIP显色法。

● 按照上述方法准备两个锡纸盒子，将硝酸纤维素膜正面朝上铺入盒子

● 取10ml检测液，分别加入66μL NBT、33μL BCIP，迅速混合。

倒入锡纸盒中，晃动3min，等条带显出来以后，加去离子水终止反应。

（13）观察条带，然后照相。

6.试剂配方附录

1.10%SDS：称10g SDS用双蒸水溶解，定容到100ml，室温放置。

2.10%过硫酸铵（1ml）：称0.1g过硫酸铵溶于1ml双蒸水中，在4℃冰箱中可保存3-4个星期。

注：过硫酸铵最好现配现用，否则必须加大用量。配两管。

3.分离胶缓冲液：1.5M pH8.8Tris.HCl

4.浓缩胶缓冲液：0.5M pH6.8Tris.HCl

5.电泳缓冲液pH8.31000mL

25mmol/L Tris 3.03g

250mmol/L甘氨酸18.77g

0.1%SDS，1g

定容至1L

6.转移缓冲液pH8.31000mL

25mmol/L Tris 3.03g

192mmol/L甘氨酸14.41g