氨基酸的薄层层析

氨基酸的薄层层析

一、实验目的

1．掌握薄层层析法的一般原理。

2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。

3．掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。

二、实验原理

1．薄层层析法是色谱分析技术的一种

一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析

吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶

硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。

硅胶吸附薄层层析的特点：

①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。

②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。但是实际操作时为70℃，活化1h 2．氨基酸与茚三酮的显色反应

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。3．记录结果，计算Rf值

混合氨基酸被分离后，在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法：

材料：

（一）分析样品：氨基酸混合液

（二）试剂：

吸附剂：硅胶

粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠、氨基酸的异丙醇溶液、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。展开-显色剂：正丁醇、乙酸、茚三酮溶液

（三）器材：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻棒、量筒、吹风机、毛细管、层析缸、药匙、烘箱

方法：

（一）薄层板的制备

1．调浆称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。

2．涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。

3．干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。

4．活化70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。

（二）点样

1．位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。

2．取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm，从左到右依次为丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，混合氨基酸。

3．点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm。（三）展层、显色

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。

（四）注意事项及要点：

1.切勿用手直接接触薄层板面。

2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。

3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。

四、结果与讨论：

1.点样与层析结果：

将薄层板放入层析缸后，随着时间的推移可看见层析缸中溶液沿着薄层板向上迁移，但无法发现点样点有变化。热风烘干后，可发现薄层板上有六个形状不一的紫红色的斑点，具体如下图2-1

如图所示，可见层析后丙氨酸距离原点的距离最远，甘氨酸次之，最后是精氨酸在颜色深度上，精氨酸颜色最深且斑点最为集中，丙氨酸次之，精氨酸最浅。

混合氨基酸总共分出了3个斑点，且高度上与前示三种氨基酸的高度相似，并伴有拖尾和重叠的现象。

2.用刻度尺测量所得结果如下图

2-2

所列表格如下

表2-1 各氨基酸色斑中心及溶液前沿至原点距离记录

测定次数

各氨基酸色斑中心至原点的距离a（cm）

丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1 混合点2 混合点3 溶剂前沿

1 2 2.45 2.20 1.45 2.42 2.18 1.40 5.00 2.42 2.18 1.44 2.44 2.18 1.40 5.00

3 2.48 2.22 1.46 2.40 2.18 1.40 5.00

平均a值 2.45 2.20 1.45 2.42 2.18 1.40 5.00 Rf值 0.49 0.44 0.29 0.49 0.44 0.28 -

*Rf值=层析斑点中心斑点至原点距离/ 溶液前沿至原点的距离根据实验原理，结合Rf值可得混合点1为丙氨酸，混合点2为甘氨酸，混合点3为精氨酸，混合氨基酸溶液为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸的混合物。

2．问题分析

3.复习思考题：

1．关于硅胶的吸附力与含水量关系的问题

硅胶属于极性吸附剂，吸附活性与含水量呈负性相关。

硅胶表面上密布极性硅醇基，可形成氢键吸附多种化合物，含水量多时硅醇基多于水分子形成氢键，而与其他化合物形成氢键减少，因而吸附力下降。

2．吸附实验中吸附剂的选择根据是什么？

应根据具体实验情况和材料搭配使用，一般参考以下特点

✓具有较大的吸附容量，比表面积大的吸附剂，一般吸附能力较强。

✓具有良好的吸附选择性，表现的优先吸附能力明显不同

✓性能稳定，有一定的机械强度和耐磨性

✓价格便宜且易于再生。

3．氨基酸薄层层析和纸层析，两者有何区别

大体上看，两者实验原理相同，并无太大区别。纸层析相比薄层层析，无需制作薄层板，材料精简，操作简单，但是准确度比薄层层析较差。因而可根据具体实验目的和实际情况选择方法。