基因诊断在遗传病检测中的应用

基因诊断在遗传病监测中的应用

目前发现人类遗传性疾病有3 000多种，如果仅依靠以往的染色体分析技术或对基因产物与代谢物的测定，我们只能对其中为数极少的一部分疾病在发病前或产前进行诊断。因为许多基因的表达有时相性和组织特异性（如有些基因在胎儿早期并不表达、苯丙氨酸羟化酶只在肝组织中表达）。用常规的方法采集的胎儿标本或其他人体材料，常常不能测出这些基因的产物或代谢产物。

然而，作为构成机体基本单位的细胞，无论其来自何种器官或组织，它们的基因组成却是完全一致的；虽然在某些特异化的组织细胞中某些基因并不表达，但那些基因的突变却存在于一切细胞之中。如果采用基因分析的方法进行监测，在个体发育的任何阶段，以任何一种有核细胞为检材，基因的缺陷都能被监测出来。

这就是近十几年来飞速发展的重组DNA技术给遗传病的早期（症状前和出生前）诊断带来的福音。重组DNA 技术不仅极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，而且同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。自从1978年发现第一个限制酶切位点多态性并应用于遗传病（镰形细胞贫血）的基因诊断以后，能够进行基因诊断的病种不断增加，方法和途径越来越多。

一、基因突变的类型

造成基因突变的原因很多，有自发的也有外界理化因素的影响。从DNA序列改变的角度来看，不外乎单核苷酸的取代和DNA片段的插入或缺失两大类型。所产生的后果取决于突变发生的位置和性质，只要影响了基因表达过程中的任何一个环节，都会导致遗传性疾病。归纳起来如表1所示

表1 基因突变及效应一览表

DNA序列的改变突变发生的部位mRNA水平的表现基因产物的改变举例

1.大片段缺失或插入

整个基因缺如缺如α地中海盆血

基因片段异常功能缺陷DMD、BMD

2.少数核苷酸的缺失或插入

外显子与内含子接界拼接异常缺如

3的整数倍外显子缩短或延长异常（氨基酸缺失或插入）Hb Leiden

非3的整数倍外显子缩短或延长异常（移码突变）β地中海盆血

3.单核苷酸取代

启动子减少减少β地中海盆血

剪接信号剪接异常缺如β地中海盆血

PolyA信号不稳定减少β地中海盆血

密码子中性突变正常

密码子错义突变氨基酸取代异常血红蛋白

密码子或内含子剪接异常缺如或移码突变β地中海盆血

密码子无义突变肽链提前终止β地中海盆血

终止密码肽链延长，量减少Hb Canstant spring

起始密码β地中海盆血缺如β地中海盆血

二、遗传病基因诊断的途径

在了解了基因突变的各种类型之后，对应用何种方法来诊断它们便很容易理解了。例如某种遗传病是由于基因缺失造成的，可通过监测受检者是否缺失该基因来直接判断其基因型。如果某遗传病是核苷酸取代造成的点突变，便可以通过监测该突变的方法（ASO探针或酶切位点监测）来进行诊断。如果致病突变或病

因还不清楚，但有相关的基因探针或已知其与某位点的RFLP紧密连锁，便可进行家系分析，通过该位点状态的连锁分析进行监测。下面根据不同的情况，举例说明基因诊断中常用的方法。

1.直接监测

（1）应用基因探针或PCR进行缺失型基因监测

部分α地中海贫血和三分之二以上的杜氏及贝氏进行性肌营养不良（DMD及BMD）是整个基因或基因片段的缺失造成的。应用基因探针（基因组DNA或cDNA探针）进行Southern印迹杂交，如果某些杂交片段消失或片段长度改变（不是由于限制酶识别位点的改变造成的RFLP），即可判定受检者有基因缺失。

应用近年来发展起来的PCR技术，也可进行缺失基因的监测。根据缺失发生区域的DNA序列，合成一对引物进行基因扩增（反应体系中必须包含有另一无关DNA片段的扩增引物，作为反应是否成功的内对照），通过凝胶电泳检查，如果没有扩增片段，便说明该基因或该DNA片段缺失，对α地中海盆血中的Hb Bart 水肿胎儿的产前诊断和DMD/BMD的产前基因诊断都是应用此法进行。

（2）造成特异限制酶切位点改变的突变基因的监测

有时，某些“点”突变（一般为单个核苷酸的取代或少数几个核苷酸的缺失或插入）正好影响了某种限制酶的识别位点（丢失或增加），对这些与基因突变相关的酶切位点的改变，可用来进行突变基因的直接监测。例如β珠蛋白基因密码子6处有一MstⅡ的识别位点（CC↓TGAGG），而在HbS病人的β珠蛋白基因，因其密码子6由GAG（谷氨酸）突变为GTG（缬氨酸），破坏了MstⅡ的识别序列。使得正常的两个杂交片段（1.15kb,0.2kb）消失，而出现一个异常的1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。许多实验室应用β-S基因的这个特异标志，直接用MstⅡ酶解β珠蛋白基因相应区域的PCR产物进行HbS病的产前基因诊断。

（3）突变位点特异性监测——ASO探针斑点杂交

绝大多数“点”突变不改变酶的识别位点，但经DNA序列分析明确基因的突变的细节之后，可人工合成针对突变位点的特异寡核苷酸（allele specific oligonucleotide,ASO）探针，进行突变基因的直接监测。ASO探针的长度一般为19个碱基，分别与被测定的突变所在区域的正常和异常DNA序列互补。在一定的杂交和洗脱条件下，只要有一个碱基不匹配，就不能形成稳定的杂交链，正常探针只能与正常基因序列杂交而不能与突变基因的序列杂交，反之亦然。1983年Conner等首先应用ASO探针进行镰形细胞贫血的基因监测，现在已广泛应用于β地中海贫血及其他遗传性疾病的基因诊断。

PCR技术的发明使ASO探针的使用更加快速简便。用PCR产物进行斑点杂交，不仅降低了同源序列的背景干扰，而且降低了对探针放射强度的要求。可以用非放射性物质进行探针标记，操作安全，并且不受同位素半衰期的限制。目前对β地中海贫血、经典型PKU等基因的诊断，都是应用此途径。

2.间接分析监测致病基因——RFLPs连锁分析

进行限制酶切片段长度多态性（RFLP）连锁分析，目前还是施行基因诊断的主要手段。对于遗传性疾病，目前了解其病因的只是其中的一小部分。即使对那些已经知道了结构基因的遗传病，由于其致病突变的细节（即核苷酸序列的改变）一时还不了解，还不能合成相应的寡核苷酸探针进行PCR/ASO监测。更不用说那些目前连其遗传缺陷的生化机理尚不明确的遗传性疾病了。对于这一类基因缺陷的监测，只能通过间接的途径，即应用RFLP连锁分析进行基因诊断。

一般说来RFLP分析所监测到的DNA多态性通常是中性突变，与基因的致病突变之间不存在连锁不平衡性，因此一个多态位点存在与否并不说明基因是否异常。只有在特定的家系中才具有一一对应的关系。

多态性位点在基因连锁分析中的应用价值，除了它与致病突变之间连锁的紧密程度以外，还与它的杂合频率有关。连锁越紧密所得结果越可靠；杂合频率越高应用价值越大。我们用多态性信息量（polymorphism information contents,PIC）来衡量，PIC是指某一家系可以利用RFLP作为遗传标志进行基因连锁分析的概率；就整个群体而言，它是指在群体中利用这些RFLP进行基因诊断的诊断率。

有时单单分析一个多态性位点，还不能将某一家系中的致病基因所在染色体与正常染色体区分开来，必须分析多个位点的状态，综合起来才能获足够的信息。我们将一条染色体上两个或两个以上与致病基因密切连锁的多态性位点状态的组合叫作染色体单倍体型（haplotype）。