辛酸硫酸铵纯化方法

辛酸_硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用_陈丹

５结束语脂质筏结构被人们认识以来，其确切的生理功能仍然
ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓｅｎｒｉｃｈｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｂｄｏｍａｉｎｓｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｐｏｒｔｔｏｔｈｅａｐｉｃａｌｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９２，６８（３）：５３３－５４４．［７］ＢＲＯＷＮＤＡ，ＬＯＮＤＯＮＥ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ
［９］ＤＡＮＩＥＬＳＥＮＥＭ．Ｌｉｐｉｄｒａｆｔｓｉｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂｒｕｓｈｂｏｒｄｅｒｓ：ａｔｙｐｉｃａｌｍｅｍｂｒａｎｅｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２００３，１６１７（１－２）：１－９．
［１３］杨福愉．生物膜结构研究的一些进展［Ｊ］．生物化学与生物物理进
有待大量研究，特别是对质膜微囊和脂筏介导的内吞途径
ａｎｄｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈｍｅｍｂｒａｎｅｒａｆｔｓ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０００，２７５（２３）：
的分子细节了解，而脂筏与微生物相互作用为这方面的研究提供了一个非常好的实验模型。通过对病原微生物如何
１７２２１－１７２２４．［８］ＳＩＬＶＩＵＳＪＲ．Ｒｏｌｅｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｎｌｉｐｉｄｒａｆｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓ
ｆｒｏｍｌｉｐｉｄｍｏｄｅｌｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２００３，１６１０（２）：
利用脂筏介导其内吞及内吞入胞后在胞内的转运的研究，

硫酸铵的生产工艺

硫酸铵的生产工艺
硫酸铵是一种常用的氮肥，其生产工艺主要包括硫酸法和铵洗法两种方法。

下面是硫酸铵的生产工艺的详细介绍：
硫酸法生产工艺：
1. 原材料准备：工业级纯化铵、浓硫酸、冷却水。

2. 将适量的浓硫酸注入反应釜中，同时开始加热，并保持密封状态。

3. 当温度达到一定值时，将预先称量好的工业级纯化铵缓慢地加入反应釜中，并同时进行搅拌。

4. 反应进行时，系统不断释放出大量的热量，因此需要冷却水来控制反应温度。

5. 反应进行到一定程度后，停止加入铵盐，继续搅拌反应一段时间。

6. 当反应结束后，将反应釜中的产物冷却，使其结晶。

7. 结晶完成后，将产物分离并进行干燥，得到硫酸铵成品。

铵洗法生产工艺：
1. 原材料准备：浓硫酸、氨水、冷却水。

2. 将适量的浓硫酸注入反应釜中，同时开始加热，并保持密封状态。

3. 当温度达到一定值时，将预先称量好的氨水缓慢地加入反应釜中，并同时进行搅拌。

4. 反应进行时，系统不断释放出大量的热量，因此需要冷却水来控制反应温度。

5. 反应进行到一定程度后，停止加入氨水，继续搅拌反应一段时间。

6. 当反应结束后，将反应釜中的产物冷却，使其结晶。

7. 结晶完成后，将产物分离并进行干燥，得到硫酸铵成品。

以上是硫酸铵的两种常用生产工艺，其中硫酸法和铵洗法均是在硫酸的存在下，通过反应得到硫酸铵的。

在反应过程中，由于系统释放大量热量，因此需要进行冷却来控制反应温度。

最后，通过结晶和干燥等工艺步骤，得到硫酸铵的成品。

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。

如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。

引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。

辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。

辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。

(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。

(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。

称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。

冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。

配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。

(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。

贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。

两种方法纯化兔抗绵羊肺炎支原体IgG的比较

ｈｇｅａａｗｔＳｍｅｏ．ｄｈ毗ＴｅｅｐｙｃａｉａｉｒｔｎｔｔｉＡｔｄＯ叫五ｈｈｈｈｈｈａｒｌｃ－ｍｍｏｉｕｆｅｍｅｏｓａｓｐｅｒｐｄａｄｉｄｎｍｕｓｌｔａｔｄｉｉｌａｉｎｈｍ．
ｅｃｅｔｍｅｏｏｎｂｄｕｉｃｔｏｉｆｉｎｔｄｆｒａｔｏｙｐｒｆａｉｎｈｉｉ
免疫球蛋白尤其ＩＧ现己广泛率，白质含量等方面比较这两种纯ｍ）ｓ —ｃ一１ｇ蛋ａ；ｗＪＦ超净工作台（苏州净化方法的提纯效果，］旨在为抗体纯化设备有限公司）Ａ１０电子天平；Ｒ４应用于生命科学的许多领域，别是特在医学诊断和基础研究中起着越来化提供一种简便实用的方法。（国ＯＡＳ公司）Ｕ２０美ＨＵ；Ｖ００型分光光越重要的作用。随着人们对免疫球蛋１材料与方法度计（尤尼柯（上海）器有限公司）仪；白性质认识的深入以及蛋白质检测１１材料．６１８型磁力加热搅拌器（上海南汇电技术的发展，免疫球蛋白纯化技术也１１１主要试剂．．讯器材厂）ＤＹ５型电泳仪（；Ｙ一北京六在不断改进。ＩＧ主要来源于血清和ｇ琼脂粉（ｏａｂｏＳｌｒｉ批号００１）６８５；仪器厂）Ｋｄｋ１胶成像系统；ｏａＤ凝Ｋｄｋ公。动物的腹水，常常在不同程度上混杂正辛酸（成都科龙化工试剂厂批号（ｏａ司）０６２１；天津市化学试剂１１３实验动物．．非抗体蛋白和脂类物质，以为消除２０１０）硫酸铵（所０６６８；Ｓ— ９０日龄健康日本大耳白兔（清洁干扰，必须对其进行纯化。在提纯ｌＧ三厂批号２００２）丙烯酰胺（ｏｇ过程中，不但要保证除去绝大多数杂ｌｒｉ批号００１）ＮＮａｂｏ７６１；，一亚甲基双级，北京兴隆实验动物饲养厂）。蛋白而且不影响ＩＧ生物活性，就丙烯酰胺（ｏａｂｏ批号００１）１２方法ｇ这Ｓｌｒｉ７２６；．需要一种好的硫酸铵法提纯兔抗绵ＥＴ（ｏａｂｏ批号００１）ＤＡＳｌｒｉ７９。１１２１兔抗绵羊肺炎支原体ＩＧ血．．ｇ羊肺炎支原体ＩＧｇ，并从纯度，回收１１２主要仪器．．清的制备按照裴艳涛嘲的免疫程序对兔子透析袋（ｏａｂｏ；Ｄ一５Ｂ台Ｓｌｒｉ）ＴＬ０山西省科技攻关项目资助．项目编号：式离心机（海安亭科学仪器厂）进行免疫，体效价合格后无菌采集上；抗２００１５ —１Ｏ６３８０３３Ｋ０型高速冷冻离心机离心机（ｉ— 血液１ｍ，置３ ℃ 作用１，再经Ｓｇ０Ｌ７ｈ

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。

说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。

上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。

PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。

2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。

3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。

二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。

（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。

拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。

无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。

将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。

然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。

（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。

用酒精棉球擦拭腹膜消毒。

用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。

硫酸铵工艺流程作用

硫酸铵工艺流程作用
硫酸铵的工艺流程主要包括硫酸铵的制备和纯化两个步骤，作用如下：
1. 硫酸铵制备：通过反应将硫酸与氨气在适当的温度和压力下反应生成硫酸铵。

这一步骤的作用是将硫酸与氨气充分反应，生成硫酸铵孵化晶石。

反应条件的控制可以调节硫酸铵的产率和纯度。

2. 硫酸铵纯化：硫酸铵产物中可能含有一些杂质，如重金属离子、杂质盐等。

纯化步骤的作用是通过一系列的分离和纯化操作，将这些杂质去除，使得最终产品的纯度达到要求。

常用的纯化方法包括结晶、过滤、洗涤等。

总的来说，硫酸铵工艺流程的作用是将硫酸和氨气反应生成硫酸铵，并通过纯化步骤去除杂质，获得纯度高的硫酸铵产品。

这样的工艺流程可以满足硫酸铵在不同领域的应用需求。

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体??辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。

如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。

引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。

辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。

辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。

(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。

(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。

称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。

冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。

配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。

(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。

贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至 4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。

小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

辛酸饱和硫酸铵纯化腹水的原理

辛酸饱和硫酸铵纯化腹水的原理
硫酸铵是一种常用的化学试剂，用于实验室中的许多应用，包
括蛋白质沉淀和DNA沉淀。

硫酸铵的饱和溶液通常用于沉淀蛋白质。

而辛酸是一种有机化合物，通常被用作溶剂或萃取剂。

腹水是指在
腹腔内积聚的液体，可能是由于疾病或其他原因导致的。

硫酸铵纯
化腹水的原理涉及到这两种化合物的特性和化学反应。

硫酸铵纯化腹水的原理主要涉及到硫酸铵的沉淀特性。

硫酸铵
在水中的溶解度随温度的升高而增加，因此通过控制温度可以使硫
酸铵在水中达到饱和溶解度，超过饱和度后硫酸铵会形成沉淀。

当
硫酸铵与腹水中的特定成分发生反应时，会形成沉淀物，从而实现
对腹水的纯化。

辛酸在这个过程中可能起到了萃取剂的作用，有助于将目标成
分从腹水中提取出来。

辛酸能与腹水中的特定成分发生化学反应或
形成复合物，从而帮助将这些成分从腹水中分离出来。

总的来说，硫酸铵纯化腹水的原理涉及到硫酸铵的沉淀特性和
辛酸的萃取作用，通过这些化学反应和物理过程，可以实现对腹水
中特定成分的分离和纯化。

这种方法可能会在实验室或工业生产中
得到应用，但具体的操作方法和条件需要根据具体情况进一步确定。

小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

血清IgG的分离纯化及测定

SPA-sepharose亲合层析法
• protein A上柱
•
• •
血清与protein A结合
清洗掉杂蛋白洗脱下所需IgG
IgG浓度测定
• 物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法 (Folin-酚法)， BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法Βιβλιοθήκη 体分离多抗纯化方法有很多种：
• • • • • 盐析法辛酸-硫酸铵沉淀冷酒精沉淀离子交换层析 Protein A,G亲和层析
盐析法
• 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，导致蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1000—10000 540 20—500 750 595
考马氏亮蓝G-250 50—500
BCA
20—200
562
紫外吸收法测蛋白质含量
• 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm处具有最大吸收量，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
• 葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG 分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPAsepharose 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
SPA-sepharose亲合层析法
• • • • • Protein A — 葡萄球菌A蛋白 Buffer A — PH8.6 磷酸盐缓冲液 Buffer B1 — PH5.5 枸橼酸缓冲液 Buffer B2 — PH4.0 枸橼酸缓冲液 Buffer C — PH8.6 Tris缓冲液

辛酸-硫酸铵法纯化细胞培养上清中单克隆抗体的条件优化

［关键词］辛酸－硫酸铵法；ｍＡｂ；纯化；正交实验
常用的单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）
离，Ｅ，３ｏｍｉｎ；重复２７７ｇ／Ｌ饱和度硫酸铵沉淀１次，终沉淀溶
辛酸一硫酸铵法纯化细胞培养上清中单克隆抗体的条件优化
刘若飞，张萃，葛如意，陈玉琼，刘晓波（广东药学院微生物学与免疫学教研室，广东Ｆ－ｋ＇ｑｌ５１０００６）
［中图分类号］Ｒ３９２．１１，Ｑ８１３．２［文献标志码］Ａ
１材料和方法
１．１材料本室建立的３株鼠源性杂交瘤细胞含血清培养
辛酸终浓度分别为（１５、２０、２５、３０、３５）Ｌ／ｍＬ的条件下进行实验。实验重复３次。１．２．５硫酸铵溶液饱和度单因素实验实验条件设定为上
量抗体丢失，为ｍＡｂ的进一步开发利用提供实验进行实验。所有实验重复３次。条件。１．２．４辛酸终浓度单因素实验实验条件设定为上清一缓冲
液体积比为１：１，硫酸铵饱和度为２４３ｇ／Ｌ，ｐＨ为６．８，在正
清－缓冲液体积比为１：１，辛酸终浓度为２０Ｌ／ｍＬ，ｐＨ为６．８，
在硫酸铵溶液饱和度分别为（２０９、２４３、２７１、３１３、３５１）ｇ／Ｌ

(抗体的纯化)硫酸铵沉淀法

抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法）一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二，试剂及仪器1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。

各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。

通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。

用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。

此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：14.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。

弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。

沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

单克隆抗体纯化

单克隆抗体的纯化一、简介抗体或免疫球蛋白（Ig）是B 淋巴细胞针对暴露于外源抗原后产生的独特的可溶性糖蛋白。

通常可从血浆（占总蛋白20%），血清，腹水，细胞培养基，蛋黄，植物提取物或细菌和酵母培养物中分离得到抗体。

常用于纯化的材料主要以腹水和细胞培养上清为主。

单抗纯化方式常用的技术：DEAE 离子交换层析柱，凝胶过滤法和亲和层析。

二、技术方法及原理（一）单抗粗提1.硫酸铵沉淀法（1）原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，故可利用不同盐浓度来沉淀不同蛋白质，硫酸铵因其溶解度大，温度系数小，不易使蛋白质变性而应用广泛。

（2）方法：①若样本体积较小，可配置100%饱和硫酸铵（375 g 硫酸铵加入500 mL 的蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出晶体任其留在瓶中，用氨水或者硫酸调节pH 至7.0）；若体积较大直接使用固体硫酸铵，根据表格（1）称取所需质量。

②盐析：缓慢向腹水中加入一定量的饱和硫酸铵溶液（或者缓慢加入固体硫酸铵，0.277 mg/mL 终浓度为45%），缓慢搅拌30 min ，室温静置2 h ，再5000 rpm 离心25 min ，去上清，沉淀用PBS 溶解。

③脱盐：主要有柱层析和透析法a）柱层析：将上述样品过Sephadex G-25 层析柱，以PBS 或Tris-HCl 缓冲液为平衡液和洗脱液，第一个蛋白峰即为脱盐后的抗体溶液；b）透析法：将样品装入处理后的透析袋（2% NaHCO3，1mM EDTA 煮沸10 min，蒸馏水洗净）中，置换缓冲溶液为PBS 或Tris-HCl 缓冲液，期间更换4-5 次透析液；2.辛酸-硫酸铵沉淀法（1）适用范围：该法简单易行，适用于提纯IgG1 和IgG2b ，但对IgG3 和IgA 的回收率及纯化效果差。

（2）试剂：0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），1M HCl，辛酸，1xPBS ，1M NaOH；（3）方法：在预处理后的腹水中加入2 倍体积的0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），按比例加入辛酸（11uL 辛酸/mL 腹水），室温搅拌下逐滴加入，30min 内加完，4℃静置2 h ，10000 rpm 离心30 min ，弃沉淀，上清过滤（经尼龙筛125uM），加入1/10 的1xPBS，再用1M NaOH 调节pH 至7.2；4℃下加入饱和硫酸铵至45% 饱和度，静置1h ，10000 rpm 离心30 min ，弃上清；沉淀用PBS 溶解；3.优球蛋白沉淀法（1）适用范围：适用于提纯IgG3 和IgM 的提取，不会影响抗体活性；复溶缓冲溶液（1M NaCl ，0. 1M Tris-HCl ，pH8.0）（2）试剂：NaCl ，CaCl2，（3）方法：取一定量的预处理后腹水，先后加入NaCl（终浓度0.2M）和CaCl2 （终浓度25mM），可看到纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，透析或层析过滤，缓冲体系为去离子水，超高速离心30min；弃上清，沉淀用1M NaCl，0. 1M Tris-HCl，pH8.0 溶液复溶，再经过透析或层析过滤更换缓冲体系；（二）亲和层析法1.基本原理：基因工程改造的protein A 和protein G 能特异性结合哺乳动物IgG 的Fc 区段，将protein A 和protein G 结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG 及其亚类与片段纯化出来。