(抗体的纯化)硫酸铵沉淀法

抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法）

一，基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二，试剂及仪器

1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等

2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 4

3. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）

4. 蒸馏水

5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)

6. 透析袋

7. 超速离心机

8. pH 计

9. 磁力搅拌器

三，操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）

1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.

2.其它不同饱和度铵溶液的配制

（二）沉淀

1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；

2.保留上清液并测量体积；

3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1

4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。弃上清保留沉淀；

2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对

PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；

3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

四，应用提示

（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。

1.边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ；

2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜（4 °C ）；

3.3000 ′g 离心30 min （4 °C ），保留上清液；上清液再加SAS 到0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加SAS 到0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效

（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。