腹水-辛酸硫酸铵沉淀法纯化
抗体纯化技术
25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。通常情况下，在24%硫酸铵饱 和度以下很少有蛋白质沉淀下来，而在55%硫酸铵饱和度时会有多数蛋白质沉淀，当硫酸铵饱 和度达到80%以上时，几乎所有的蛋白质都会沉淀下来。
硫酸铵溶解度高，溶于水时产生的热量少，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性。
亲和层析法
概念
利用蛋白质分子对其配体分子的特异识别和可逆结合的特性建立起来的一种有效的分离纯化方 法。
蛋白A/G亲和层析
Protein A/G是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合 的结构域，可结合多种免疫球蛋白的Fc部分，特异性结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化 敏感，会随pH的降低而急剧下降，因此可用于纯化不同来源的抗体及抗体亚型。该法具有极 高的选择性，通常一步层析就可达到超过95%的纯度。
其他沉淀方法
有机溶剂沉淀
概念：利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀.
原理：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 特点：沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂容易除去；易影响蛋白质的活性，故应在低温下操
作并注意搅拌。
聚乙二醇沉淀
概念：在一定盐浓度条件下向溶液加入亲水性极强的聚乙二醇(PEG)引起大分子溶质非特异性 凝聚沉淀的方法。
其他沉淀方法-续
辛酸-硫酸铵沉淀
原理：在酸性条件下（pH4.8）向血清中加入一定量的短链脂肪酸，使血浆蛋白中的清蛋白、 α 及β免疫球蛋白成分沉淀，取以IgG成分为主的上清液再经硫酸铵沉淀得到进一步纯化。
等电点沉淀
概念：利用蛋白质在等电点(pI)时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离 的方法。
辛酸硫酸铵纯化方法
所需溶液配制：1.0.06mol/L pH=4.8醋酸盐缓冲液：无水醋酸钠0.29g，冰醋酸0.141mL，纯水定容至100mL。
2.2mol/L氢氧化钠溶液：16g氢氧化钠固体用于200ml纯水中。
3.2mol/L盐酸溶液：取33m L36.4%的浓盐酸定容至200mL纯水中。
4.0.1mol/L PBS缓冲液：80.0 NaCl，KCl 2.0g，Na2HPO4· 12H2O 29.0g，KH2PO4 2.0g，加超纯水定容至1L。
单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵方法纯化，具体步骤如下：（1）将腹水从-20°C冰箱拿出室温解冻。
腹水用双层滤纸过滤，初步除去杂质、脂肪及细胞碎片。
4°C,12000r/min，离心15min，收集上清，弃沉淀。
精确定量腹水体积。
（2）一份体积的腹水与2-4份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCL 调PH至4.5-4.8。
（3）磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，33μL/mL腹水，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4°C静置2h以上。
（4）4°C ,12000r/min，离心5min，收集上清，双层滤纸过滤，收集滤液。
（5）量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH=7.4 的PBS,用2mol/L NaOH（记录NaOH 体积）调pH至7.4。
（6）将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4°C过夜。
（7）12000r/min，离心15min，弃上清。
用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。
用PB 透析两天后换0.01mol/LPBS 透析两天。
收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20°C预冻后真空冻干成粉保存。
张道宏师姐版本：用1/10原腹水体积的0.01mol/L pH值7.4 PBS溶解沉淀；对0.01mol/L pH值7.4的PBS透析一天，离心去掉不溶杂质，用纯水进行透析，优球蛋白析出后离心收集澄清抗体溶液，置于-20°C预冻；冻干保存。
抗血清纯化
辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非lg蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将lg沉淀下来。
实验流程：血清或者腹水↓辛酸沉淀（室温）↓→沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（lgG）↓硫酸铵沉淀（4度）↓→上清液沉淀↓溶解沉淀↓透析（4度）实验操作：原料：待纯化的血清（-20度长期保存，实验前4度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、50ml离心管、透析袋、透析夹。
试剂：1.乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L,pH4.02.10×磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）：100mmol/LPBS，pH7.4。
称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO42g,加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA20ml，用去离子水定容至1000ml。
3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一）辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍(2-4倍)体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终PH为4.5）（PH4.5-4.8）2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的1%）（25ul/33ul辛酸：1ml血清稀释液），滴加完后继续搅拌30min3.离心（10000r/min，30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二）硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10×PBS，用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液(4度按277g/L硫酸铵粉末)，边加边搅拌，加完后继续搅拌2小时以上或者4度过夜7.离心（8000r/min、20min），弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂2）（原血清体积的1/10）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9‰ NaN3硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
白丽;钱金;王晶
【期刊名称】《大理学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2000(009)004
【摘要】目的:从小鼠腹水和血清中纯化IgG抗体.方法:首先用辛酸沉淀小鼠腹水和血清中的非免疫球蛋白,然后用固体硫酸胺提取抗人T和B细胞白血病单克隆抗体(IgG1和Ig2b)和多克隆IgG抗体.结果:经SDS-PAGE和活细胞免疫荧光法鉴定,获得了纯度高、活性好的抗体,腹水中单抗的回收率达80%以上.结论:本方法是一种简单、价廉且有效的纯化小鼠腹水和血清IgG抗体的方法.
【总页数】2页(P3-4)
【作者】白丽;钱金;王晶
【作者单位】大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用 [J], 陈丹;孙广瑞;柳增善
2.改良的紫外荧光光度计法检测小鼠血清中多巴胺β羟化酶活性的方法 [J], 刘林林;孙宝胜;杨巍;刘晓岚
3.ELISA法检测囊尾蚴虫病IgG抗体中弱阳性质控血清的制备及应用 [J], 杨柳莹;孙黎;赵仪;陈曦阳;王晓凤;凌攀
4.应用辛酸硫酸铵法提取纯化兔IgG [J], 马贵军;韩素娟;剡根强;周霞
5.辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性IgG抗体中的应用 [J], 刘俊琴;申丽洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗血清纯化
辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非 lg 蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 lg 沉淀下来。
实验流程：血清或者腹水辛酸沉淀（室温）J 一沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（ lgG）硫酸铵沉淀（ 4 度）J -上清液沉淀溶解沉淀透析（ 4 度）实验操作：原料：待纯化的血清（ -20度长期保存，实验前 4 度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、 50ml 离心管、透析袋、透析夹。
试剂： 1. 乙酸- 乙酸钠缓冲液： 60mmol/L,pH4.02.10 X磷酸盐-NaCl 缓冲液（PBS： 100mmol/LPBS pH7.4。
称 NaCI 80g、NQHP02HO29g、KCI 2g、KHPO2g,加蒸馏水溶解，加入 100mmol/LEDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml。
3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一：辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍（2-4倍）体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终 PH为4.5）（PH4.5-4.8 ：2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的 1% ：（25ul/33ul 辛酸： 1ml血清稀释液：，滴加完后继续搅拌 30min3.离心（10000r/min， 30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二：硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10X PBS用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液 4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液（4 度按 277g/L 硫酸铵粉末），边加边搅拌，加完后继续搅拌 2 小时以上或者 4 度过夜7.离心（8000r/min、20min）,弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂 2）（原血清体积的 1/10 ）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9 %。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
三种方法纯化相思子毒素单抗的比较
随着人类对生命 科学研究的深入 ， 克隆抗体 ２— 核酸蛋 白检测仪 ， 单 １１ 上海青浦沪西仪器厂； Ｍ１ Ｌ ７
现 已广泛应 用 于生 命 科 学 、 疫 学 、 物 化 学 、 子 型记 录仪 ， 青示 波 器 厂 ； Ｔｒｐ Ｍ ｒｔｉ 免 生 分 永 Ｈｉ ａ Ｔ １ｍＬｐｏｅ ｎ
（ 吉林大学畜牧兽医学院 ， 吉林长春 １ ０ ６ ） ３ ０ ２
采 用硫酸铵沉淀法 、 酸一 酸铵 法和硫 酸铵一 辛 硫
１ １ 材料 ．
相思子毒索单抗腹水 由本实验室制
蛋 白 Ａ 亲和 层 析 法 三 种 方 法分 离 纯化 相 思 子 １１１ 试剂 ＿．
毒素单抗 ， 并采 用十 二 烷基 硫 酸 钠 聚 丙烯 酰 备， 蛋白检测试剂盒（ ｃ ｒｔｎＡ ｓ ｉ 自 Ｂ Ａ Ｐｏｅ ｓ ｙ ｔ ｉ ａＫ ）
维普资讯
罗胜军等 ： 三种方法纯化相思 子毒 索单抗 的比较
７ ３
淀用适 量 Ｐ Ｓ溶解 后 吸出并 装 入 透 析袋 内 ， ４＿ Ｂ 于 Ｃ 条件 下 ， １ ０倍 体积 的 Ｐ Ｓ透 析 ２ ， 对 ０ Ｂ ４ ｈ 中途 换 液
３次～４次 。取 出透 析袋 ， 出蛋 白溶 液 ， ４℃条 吸 在 产物， 分装后 于 一２ ０℃保存 ［ １ ］
酸铵 沉 淀 法较 差 ； 同 方 法 纯 化 后 的 单 抗 活 统有限公司； －４５ 不 ＷＤ ９０Ｂ型水平摇床 ， 沃德生物医学 性 未见 降低 仪器公司； 量 可调 移液 器 ， 微 芬兰 Ｅ Ｐ ＭＤ Ｆ公 ＰＥ Ｏ
：
关键词 ： 思子毒 素 ； 相 单克 隆抗体 ； 纯化
司；Ｈ ３０ Ｔ 一０ 梯度混合器， 上海青浦沪西仪器厂； Ｄ Ｈ
－ 一
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
辛酸饱和硫酸铵纯化腹水的原理
辛酸饱和硫酸铵纯化腹水的原理
硫酸铵是一种常用的化学试剂，用于实验室中的许多应用，包
括蛋白质沉淀和DNA沉淀。
硫酸铵的饱和溶液通常用于沉淀蛋白质。
而辛酸是一种有机化合物，通常被用作溶剂或萃取剂。
腹水是指在
腹腔内积聚的液体，可能是由于疾病或其他原因导致的。
硫酸铵纯
化腹水的原理涉及到这两种化合物的特性和化学反应。
硫酸铵纯化腹水的原理主要涉及到硫酸铵的沉淀特性。
硫酸铵
在水中的溶解度随温度的升高而增加，因此通过控制温度可以使硫
酸铵在水中达到饱和溶解度，超过饱和度后硫酸铵会形成沉淀。
当
硫酸铵与腹水中的特定成分发生反应时，会形成沉淀物，从而实现
对腹水的纯化。
辛酸在这个过程中可能起到了萃取剂的作用，有助于将目标成
分从腹水中提取出来。
辛酸能与腹水中的特定成分发生化学反应或
形成复合物，从而帮助将这些成分从腹水中分离出来。
总的来说，硫酸铵纯化腹水的原理涉及到硫酸铵的沉淀特性和
辛酸的萃取作用，通过这些化学反应和物理过程，可以实现对腹水
中特定成分的分离和纯化。
这种方法可能会在实验室或工业生产中
得到应用，但具体的操作方法和条件需要根据具体情况进一步确定。
硫酸铵沉淀法
抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法）一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
抗体纯化方法汇总与比较
抗体纯化方法汇总与比较
1. 概论
制备出效价高，特异性强，稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础，抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败，不同的免疫学实验方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）对抗体的效价，浓度和纯度有不同的要求。
我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。
下面就一一介绍常用抗体纯化方法及其相关原理。
免疫球蛋白主要有5种，轻链和重链的组成也有较大差异。
其结构如下图所示：
各类免疫球蛋白有不同的亚型，下图展示人免疫球蛋白各亚型的理化性质：
2. 沉淀法
硫酸铵/辛酸沉淀法是纯化抗体最传统的方法之一，被广泛用于血清和腹水抗体的浓缩和粗纯，此方法可大规模粗纯抗体，但纯化后纯度不高，还需配合其它方法继续纯化。
通常是将饱和硫酸加入血清或腹水中，将抗体沉淀下来，然后在溶解沉淀继续下一步的纯化。
辛酸沉淀抗体通常要先将腹水或血清的pH调至4.8，然后缓慢的滴加辛酸，是蛋白沉淀，抗体在上清中，上清继续下一步的纯化。
3. 离子交换层析
离子交换层析也常用于抗体的纯化，通量大，工业上用离子交换层析成本低，主要用于除去非抗体蛋白，及用亲和层析纯化时混入的Protein A/G等亲和填料脱离的配基，内毒素的去除等。
离子交换纯化时，根据抗体的pI选择合适的离子交换类型，在pI未知时可以分别用阴阳离子交换填料去试验。
辛酸-硫酸铵沉淀纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵沉淀纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
27抗体的纯化——沉淀法
抗体的纯化方法很多,最为常用的为以下四种方法，基于工业化生产工艺开发的规模化生产方法要比这些复杂得多，甚至多个纯化策略联合使用，有兴趣的科研工作者可以查阅相关的文献。
1）沉淀法：利用抗体蛋白疏水性不同，提高盐离子浓度蛋白沉淀，常用的沉淀方法有硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法和聚乙二醇沉淀法；这类纯化各有各的优缺点，往往对某些亚型抗体有偏爱性。
2）广谱亲和纯化：这类纯化主要是利用金黄色葡萄球菌ProteinA /G蛋白可以特异性与抗体的Fc结合的原理进行的。
3）抗原特异性纯化：将特异性的抗原偶联到琼脂糖凝胶等固相载体上，纯化方法与ProteinA /G纯化方法相同。
4）离子交换法：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。
用NaOH 将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。
pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。
1. (NH4)2SO4沉淀法纯化抗体1.1 饱和硫酸铵配制：无菌去离子水加入足量硫酸铵之后，加热到65℃以上，在磁力搅拌器上搅拌溶解至底部仍有未溶解的硫酸铵，待冷却后，取上清滤纸过滤。
1.2 样品（血清或腹水），12,000rpm离心30min（4℃），除去细胞碎片，保留上清液并测量体积。
1.3 边搅拌边缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液到上清液中，溶液放在磁力搅拌器上室温搅拌6h或搅拌过夜（4℃），使蛋白质充分沉淀。
1.4 蛋白溶液12,000rpm离心30min（4℃），沉淀用原样品体积的PBS溶液重悬，重悬后12,000rpm离心10min（4℃），上清转移到一个新离心管。
(抗体的纯化)硫酸铵沉淀法
抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法）一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二，试剂及仪器1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：14.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
单克隆抗体纯化
单克隆抗体的纯化一、简介抗体或免疫球蛋白（Ig）是B 淋巴细胞针对暴露于外源抗原后产生的独特的可溶性糖蛋白。
通常可从血浆（占总蛋白20%），血清，腹水，细胞培养基，蛋黄，植物提取物或细菌和酵母培养物中分离得到抗体。
常用于纯化的材料主要以腹水和细胞培养上清为主。
单抗纯化方式常用的技术：DEAE 离子交换层析柱，凝胶过滤法和亲和层析。
二、技术方法及原理（一）单抗粗提1.硫酸铵沉淀法（1）原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，故可利用不同盐浓度来沉淀不同蛋白质，硫酸铵因其溶解度大，温度系数小，不易使蛋白质变性而应用广泛。
（2）方法：①若样本体积较小，可配置100%饱和硫酸铵（375 g 硫酸铵加入500 mL 的蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出晶体任其留在瓶中，用氨水或者硫酸调节pH 至7.0）；若体积较大直接使用固体硫酸铵，根据表格（1）称取所需质量。
②盐析：缓慢向腹水中加入一定量的饱和硫酸铵溶液（或者缓慢加入固体硫酸铵，0.277 mg/mL 终浓度为45%），缓慢搅拌30 min ，室温静置2 h ，再5000 rpm 离心25 min ，去上清，沉淀用PBS 溶解。
③脱盐：主要有柱层析和透析法a）柱层析：将上述样品过Sephadex G-25 层析柱，以PBS 或Tris-HCl 缓冲液为平衡液和洗脱液，第一个蛋白峰即为脱盐后的抗体溶液；b）透析法：将样品装入处理后的透析袋（2% NaHCO3，1mM EDTA 煮沸10 min，蒸馏水洗净）中，置换缓冲溶液为PBS 或Tris-HCl 缓冲液，期间更换4-5 次透析液；2.辛酸-硫酸铵沉淀法（1）适用范围：该法简单易行，适用于提纯IgG1 和IgG2b ，但对IgG3 和IgA 的回收率及纯化效果差。
（2）试剂：0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），1M HCl，辛酸，1xPBS ，1M NaOH；（3）方法：在预处理后的腹水中加入2 倍体积的0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），按比例加入辛酸（11uL 辛酸/mL 腹水），室温搅拌下逐滴加入，30min 内加完，4℃静置2 h ，10000 rpm 离心30 min ，弃沉淀，上清过滤（经尼龙筛125uM），加入1/10 的1xPBS，再用1M NaOH 调节pH 至7.2；4℃下加入饱和硫酸铵至45% 饱和度，静置1h ，10000 rpm 离心30 min ，弃上清；沉淀用PBS 溶解；3.优球蛋白沉淀法（1）适用范围：适用于提纯IgG3 和IgM 的提取，不会影响抗体活性；复溶缓冲溶液（1M NaCl ，0. 1M Tris-HCl ，pH8.0）（2）试剂：NaCl ，CaCl2，（3）方法：取一定量的预处理后腹水，先后加入NaCl（终浓度0.2M）和CaCl2 （终浓度25mM），可看到纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，透析或层析过滤，缓冲体系为去离子水，超高速离心30min；弃上清，沉淀用1M NaCl，0. 1M Tris-HCl，pH8.0 溶液复溶，再经过透析或层析过滤更换缓冲体系；（二）亲和层析法1.基本原理：基因工程改造的protein A 和protein G 能特异性结合哺乳动物IgG 的Fc 区段，将protein A 和protein G 结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG 及其亚类与片段纯化出来。
单克隆抗体治疗肾综合征出血热患者的初步观察
单克隆抗体治疗肾综合征出血热患者的初步观察
徐志凯;汪力亚
【期刊名称】《中华实验和临床病毒学杂志》
【年(卷),期】1996(010)003
【摘要】选择具有高中和活性和血凝抑制活性，且对肾综合征出血热病毒感染乳具有良好保护作用的抗－ＨＦＲＳＶＭｃＡｂ腹水，经辛酸－硫酸铵沉淀法纯化成ＩｇＧ。
在纯度鉴定，免疫学活性测定及各种安全性试验合格的基础上，首次试用于３例ＨＦＲＳ患者的治疗。
结果表明，使用安全，疗效良好。
随访观察１１个月，无异常反应。
【总页数】3页(P284-286)
【作者】徐志凯;汪力亚
【作者单位】第四军医大学微生物学教研室;第四军医大学微生物学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R512.805
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