酶切与连接

（2）DNA甲基化的程度


核酸限制性内切酶是原核生物限制－修饰体系 的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲 基化作用，会强烈的影响酶的活性。通常从大 肠杆菌细胞中分离的质粒DNA，都混有特定核 苷酸序列的甲基化酶： 1 Dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残 基甲基化。 2 Dcm甲基化酶，催化cca\tgg序列中内部的胞 嘧啶残基的甲基化。 所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大 肠杆菌制备质粒DNA。
酶切与连接
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸
二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解 断裂的蛋白酶。 分两类： 1 核酸外切酶，从核酸链的一端逐个水解核甘酸的 核酸酶。 2 核酸内切酶，能够水解核酸分子内磷酸二酯键 的核酸酶。
一 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割
(3 )酶切消化反应温度

酶切标准温度是37℃，但是某些特殊的酶最适合 温度是例外的，比如SmaⅠ是30℃。 过高或者过低的温度会使内切酶失去活性。

（4） DNA的分子结构

DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有 很大的影响。当DNA分子为线性的时候最容易， 当DNA分子存在二级结构的时候，酶切的活力就 会大大降低。
（5 ）限制性内切酶的缓冲液
缓冲液一般的组成部分包括：氯化镁、Tris-Hcl, 巯基乙醇或者二硫苏糖醇（DTT），牛血清蛋白 （BSA）等。 适合的二价金属离子浓度,通常为Mg离子。 适合的PH 通常为7.4左右。

限制性内切酶的星号活性
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性， 但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条 件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的 特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改 变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星 号表示，因此第二活性又称星号活性。概括起来， 诱导星号的因素有以下几种： 1,高甘油含量(>5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高 (100u/ug DNA)；3,低离子强度(<25mmol/L);4,高 ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等， 6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）

同裂酶和同尾酶
同裂酶是指一些来源不同的限制酶识别位点和切 割位点的核苷酸靶序列完全一样。产生同样的切 割，形成同样的末端。 同尾酶对应一类限制酶，他们虽然来源各异，识 别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末 端。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后 所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别 和切割。
（3） 衔接物连接法
衔接物：指合成的两条互补的寡核苷酸，使其配 对后一端为平末端，另一端为为黏性末端，或两 端为不同的黏性末端的片段。 衔接头可以使DNA片段的平末端转变为黏末端， 或由一种黏末端转变为另一种黏末端，并且无需 用限制酶切。 例如：EOCRI-SMAI平末端衔接物 5`…AATTCCCGGG…3` 3`…GGGCCC…5`
（1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液
（1）DNA 纯度




污染在DNA制剂中的某些物质，例如：蛋白质、 酚、酒精、异丙醇、EDTA、高盐离子等。所以 在纯化过程中，空摔一定要时间充足，要彻底； 用微碱的TE洗脱； 提高限制内切酶的用量； 延长酶切时间； 扩大酶切体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释。




影响连接效率的因素： A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值 E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。
2．几种连接方式
A 用粘性末端DNA片断的连接 B 平端DNA片断的连接
A 用粘性末端DNA片断的连接
用特定限制性内切酶酶切过的质粒载体与以相同 酶酶切过的具有粘性末端的DNA片断连接。 载体可能自发的环化，这时可以用碱性磷酸酶处 理酶切过的质粒载体，移去末端的5`磷酸基团， 这样质粒载体就不能自发的环化了。而DNA片断 在与这种载体连接后，会留下一个3`-OH和5`-OH 的缺口，这种情况下仍然可以导入宿主菌。这种 分子在宿主菌中完成缺口的修复。

2．Ⅱ型限制性内切酶的基本特性
Ⅱ型限制性内切酶的识别序列通常由4~8个碱基 对组成，它们具有二重旋转对称轴，这些碱基对 的序列呈回文结构。所以限制酶切割DNA后，均 产生含5`磷酸基和3`羟基的末端。限制酶作用所 产生的DNA片段有以下两种形式： （1）形成黏性末端 不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结 果形成的DNA限制片段具有黏性末端。

B 平端DNA片断的连接
（1） 直接用T4ligase连接 （2） 同聚物加尾法 （3） 衔接物连接法
（1）直接用T4ligase连接
提高平末端连接效率常用措施 提高T4DNA连接酶浓度； 提高DNA片段浓度； 降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合； 加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA的静电排 斥力； 加浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、 强水化物三氯化六钴等。
（2）同聚物加尾法

末端脱氧核苷酸转移酶，它能够将核苷酸加到 DNA分子单链延伸末端的3`-OH基团上。当只加 入DNA，dATP和末端脱氧核苷酸混合反应物时 产生poly A的尾巴。 加入dTTP 产生poly T尾巴。 这样两个用互补基团延伸过的DNA和载体，就能 连接在一起（相当于有了个粘末端）。

例如:BamHⅠ和Bgl Ⅱ

BamHⅠ的识别序列 和切割位点：

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Bgl Ⅱ的识别序列和 切割位点：
G↓GATC C C CTAG↑C
A↓GATC T T CTAG↑A
相连后，其序列变为GGATCT CCTAGA， 与原来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不 再为原来的酶所切割。
3. 影响核酸限制性内切酶活性的因素

二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接

核酸限制性内切酶将DNA分子切割为不同大小的 片断，然而要将不同来源的DNA片断组成新的杂 种DNA分子，还必须将他们彼此连接并且封闭起 来。
1．DNA连接酶

能够催化两个双链DNA片段相邻的5`端磷酸与3` 端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链 DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA 片段进行连接，是一种吸能反应，需要能源物质 NAD+或者ATP。DNA连接酶并不能连接两条单 链的DNA，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分 子的一部分。即封闭DNA缺口上的缺口 nick，而 不能封闭裂口gap 。DNA连接酶主要有两种：一 种是T4DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接 酶。
HpaⅠ的识别序列是： 5`…G ↓ TTAA C…3` 3`…C AATT ↑ G…5`
（3）限制片断末端的连接作用 许多种限制酶切割DNA分子形成的短片断能 够自发的重新环化起来。如果环化分子加热后又 会重新线性化。但是，如果马上使用连接酶处理， 使他们的3－OH基团和5—P基团之间封闭起来， 环化就是永久的了。 连接分为：分子间连接和分子内连接。
1．简介 核酸限制性内切酶：是一种在特殊核甘酸序列处 水解双链DNA的内切酶 ，简称限制性酶。 限制性酶分三型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ Ⅰ型酶结合于识别位点并随机的切割识别位 点不远处的DNA，而Ⅲ型酶在识别位点上切割 DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ型限制酶的限制 修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组 成，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独 立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

例如，Hind Ⅲ切割结果形成5`单链突出的粘性末 端；而Pst Ⅰ切割结果却形成3`单链突出的粘性 末端。 （2）形成平末端 有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的 DNA片段具有平末端。例如HpaⅠ切割结果形成 平末端。




Hind Ⅲ的识别序列是： 5`…A ↓ AGCT T…3` 3`…T TCGA ↑ A…5`
机理：

1、ATP（NAD）与酶结合产生 E－AMP＋ppi
即E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi

大肠杆菌DNA连接酶，E(酶)＋NAD+→E－AMP ＋NMN（烟酰胺单核苷酸）
2、E－AMP上的AMP转移到DNA的 5'－PO4上使其活化 3、活化的5`－PO4与相邻的3`－OH作用形成3` －5`磷酸二酯键，并释放出AMP。但连接酶不能 连接单链，必须要有模板的存在。也不能连接3` －OH和5`－PPP以及DNA与RNA。在后滞链的 合成，DNA损伤的修复，重组及转座中DNA连接 酶都发挥着重要的作用 。


限制修饰系统简称 R/M系统 restriction modification
类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外来 的DNA，并使外来的DNA降解。 由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制 性内切酶。 当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞 时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体 内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异 的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分 核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化 核酸序列是限制性酶无法作用的。