双酶切及连接

限制性内切酶的类型

根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
限制性内切酶的类型

第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
dna完全没有被内切酶切割原因对策内切酶活性下降内切酶稀释不正确dna不纯反应条件不佳内切酶识别的dna位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分dna溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大取样不准酶切后dna粘末端退火由于反应溶液温度强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序用510倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释增大取样体积电泳前将样品置65保温510分钟取出后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度避免强烈振荡适当稀释酶液反应液稀释的酶不能贮藏使用最佳反应体系加大酶量510倍问题二
限制性内切酶的类型
第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的
识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。
限制性内切酶的类型

第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。

双酶切连接反应之全攻略(

双酶切连接反应之全攻略(双酶切连接（Double Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于在DNA分子上选择性地切割两个特定的限制性内切酶位点。

它可以用于构建重组DNA，进行基因克隆，等等。

下面是一个全面的双酶切连接反应的攻略，包括实验前的准备工作，实验步骤和注意事项。

实验前的准备工作：1.获得限制性内切酶：选择两个互不相容的限制性内切酶。

确保这两个酶能够在相同的反应缓冲液中活性工作。

2.准备DNA底物：获得需要连接的DNA片段。

可以通过PCR扩增，限制性消化或DNA合成等方法获得。

3.选择连接载体：选择合适的连接载体，如质粒。

确保载体具有想要插入的目标基因的适当特性，如选择性标记物（如抗生素抗性基因）和启动子等。

4.验证限制酶位点：使用限制性内切酶图谱检测DNA片段和连接载体中的限制酶位点。

这有助于确定两个限制酶是否能够溶解目标DNA片段。

实验步骤：1.提取DNA：从细菌培养基中提取所需的DNA片段。

可以使用商用试剂盒或自制提取方法。

2.酶切反应：在适当的反应条件下，将需要连接的DNA片段和连接载体分别与两个限制性内切酶一起孵育。

反应条件包括酶的浓度，缓冲液的类型和pH值，反应温度和孵育时间。

3.酶停止反应：通过加入酶停止缓冲液或加热短暂孵育，停止酶切反应。

这样可以避免过度消化和限制酶反应继续进行。

4.凝胶电泳：将切割后的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分析。

这一步骤可以检测酶切效率和特异性。

将反应样品和相应的对照样品（未经酶切）加载到琼脂糖凝胶上，然后运行电泳以分离DNA片段。

5.库仑凝胶纯化：根据所选的DNA片段大小，可以选择不同浓度的琼脂糖凝胶切片进行纯化。

将所需大小的DNA片段切割下来并进行库仑凝胶分离。

6.连接反应：将纯化的DNA片段与连接载体进行连接反应。

可以使用商业化的连接试剂盒，其中包含待连接DNA和连接载体之间的连接酶，以及其他必要的试剂。

7.转化：将连接后的DNA样品转化到合适的宿主细胞中。

双酶切连接反应的注意要点

双酶切连接反应的注意要点1.选择适当的酶切位点：在进行双酶切连接反应之前，需要选择适当的酶切位点。

这些酶切位点应该满足以下几个要求：-位点不应该在目标DNA序列中出现，以避免酶切产生剪切产物；-两种酶切位点应该在目标DNA序列中相对靠近，以确保连接的有效性；-酶切位点的序列应该被两种酶同时识别和切割。

2.协议的优化：双酶切连接反应的协议需要进行优化，以确定最适合的条件。

一些重要的实验条件包括反应缓冲液的成分和浓度、酶的浓度和反应温度。

对于每个反应参数，应该进行范围的优化实验，以确定最佳的条件。

3.应用正确的酶切酶：双酶切连接反应需要同时使用两种酶来进行切割。

这些酶应该是互相兼容的，并且能够在相同的反应缓冲液中活性。

此外，酶的纯度和活性也应该得到保证，以确保酶切的效果。

4.反应的时间和温度：双酶切连接反应的时间和温度都需要进行优化。

反应时间应该足够长，以确保两种酶都能充分切割目标DNA序列，并且不会出现过度切割的情况。

反应温度也应该适中，通常在酶的推荐温度范围内选择。

5.质量控制：在完成双酶切连接反应之后，应该进行质量控制以确保反应的成功。

常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。

通过这些方法，可以检测连接产物的大小和纯度，并确认连接的正确性。

6.反应产物的处理：根据实验需要，对双酶切连接反应的产物进行处理。

这可能包括：-凝胶电泳分离：使用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的连接产物；-提取纯化：通过凝胶电泳或商业化学试剂盒，从琼脂糖凝胶中提取并纯化连接产物；-DNA测序：对连接产物进行测序，以确认连接的正确性。

总之，双酶切连接反应是一种常用的分子生物学技术，但在实验中需要注意一系列要点。

选择适当的酶切位点、优化实验条件、正确选择酶切酶、时间和温度的控制，以及进行质量控制和反应产物的处理，对于确保双酶切连接反应的成功至关重要。

这些注意要点的遵守可以确保实验结果的准确性和可靠性。

连接双酶切

连接双酶切连接双酶切PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体可能的原因，1.表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短2.连接最好是12～16小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适3.回收胶的问题今天酶切时没有和空载体对比，TE，含有EDTA，会抑制连接酶的活性洗下来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上1：在使用 Wash Buffer 洗涤前，在柱子中加入少量 (200ul) 溶胶液。

室温3-5 分钟后，离心。

再接标准洗涤及以后操作。

该操作针对胶块大的情况。

2：加入 Wash Buffer 后，静置 1-3 分钟后，再离心。

3：增加 Wash Buffer 的洗涤次数 (少量多次)。

胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问题，同时也会导致溶胶液中盐的残留 - 这似乎对连接影响更大。

最好的解决方法是 1；当然，可能会导致得率的小量下降，但质量绝对好。

为了充分去除残留，总结，1.多加一步200ul溶胶液，2.加 Wash Buffer 前空柱离心 30 sec，3.Wash Buffer洗涤时静置及多次柱子允许胶通过的量是有限的，胶越多或是浓度太大，残留就会更明显，所以切胶时应该尽量要小，假如过大的话分到两个柱子里应该比较好，另外就是溶胶液宁可多加也不能少加首先要保证待测质粒的纯度,除PCR外,可以对重组质粒做两个双酶切反应：1.ECoR I与Xh0 I双酶切; 2.选一个插入片段中特异存在的切点酶和质粒ECoRI下游到Xba1间的合适位点酶(插入片段中没有的),进行双切,结果可以预测到.每个双切反应包括酶1单切,酶2单切,双切三个反应,别忘了以空载体做对照.试试看.如果没有得到重组质粒只好再连接反应了.酶是TAKARA的,方法就是按说明书上做的,酶各1微升,buffer 2微升,质粒5微升,20微升体系.遇到双酶切可是两个酶没有共用buffer时两种办法：一是低盐buffer的酶先切，然后乙醇沉淀回收，然后高盐buffer的酶再切，乙醇沉淀或切胶回收。

双酶切连接反应

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。

现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为××=µg。

实验报告双酶切实验目的(3篇)

第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。

2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。

4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。

5. 培养实验操作规范，提高实验技能。

二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。

3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。

三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。

2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。

四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。

2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。

3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。

4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。

5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。

6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。

7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。

8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。

9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。

双酶切连接

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。

现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

2.纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒3.酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

双酶切连接反应的注意要点

双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。

因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。

有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。

3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。

酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。

4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。

5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。

6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

双酶切连接反应之全攻略

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。

现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

双酶切

反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带，可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带，可能是酶切后DNA片段太小，导致结果模糊。
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切 • 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
李婷王鹏飞王鹏飞高峰高峰实验原理实验原理用限制性内切酶去切割dna片断由于酶具有专一性一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列所以可以用特定的这种酶去切割相应的dna片断进而达到定向切割的目的
双酶切及连接
指导老师：陈思组员：李婷王鹏飞高峰姜威邵振天
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶具有专一性，一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向切割的目的。
思考题
影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度酶切消化反应的温度 DNA的分子结构溶液中离子浓度及种类缓冲液的pH值

实验2 酶切片段回收和连接

酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。

本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。

说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。

关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。

构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。

对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。

基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。

基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。

近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。

现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。

在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。

这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。

尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。

双酶切连接反应全攻略

双酶切连接反应全攻略一、实验材料和试剂准备1.DNA片段：需要连接的两个DNA片段，通常分别由PCR法或酶切法获得。

2. 双酶切酶：选择两种具有互补端切位点的酶，如常用的 EcoRI 和HindIII。

3.T4DNA连接酶或其他适用的连接酶。

4.DNA连接试剂盒：如T4DNA连接试剂盒等。

5.反应缓冲液：根据连接酶选择合适的反应缓冲液。

二、双酶切连接反应步骤1.酶切：将两个DNA片段用各自的切割酶酶切，生成互补的粘性末端。

注意，切割反应需要在适当的反应缓冲液和温度下进行，在所选择的酶切位点附近不得有其他酶切位点。

2.酶活化：将酶切后的DNA片段进行热变性处理，加入适当的酶活化缓冲液，在65-80℃下进行5-10分钟的热处理，以去除酶切过程产生的内切酶的限制性影响。

3.连接反应：将酶活化处理后的DNA片段加入连接反应体系中，加入适量的连接酶和缓冲液，并在适当的温度下进行连接反应。

连接反应温度一般为16-20℃，反应时间根据试剂的不同而有所差异，一般为2-4小时至过夜。

4.构建：将连接反应后的DNA取出，可根据需要进行进一步的DNA构建，如转化到宿主细胞中进行复制或进行其他分子生物学操作。

三、实验条件和注意事项1.酶切反应：根据所选择的切割酶的活性要求选择合适的反应缓冲液和酶切温度。

2.热变性处理：确保将酶切后的DNA片段充分变性，去除酶切产生的限制性影响，但同时避免过度变性导致DNA不可恢复的损伤。

3.连接反应：根据所选择的连接酶和试剂盒的要求进行适当的缓冲液和温度选择。

4.连接效率：连接效率可能受到多种因素的影响，如DNA片段的完整性、浓度、连接酶的活性和反应条件等。

在实验过程中，可以调节影响连接效率的参数来优化实验结果。

5.阳性对照：在连接试验中可以设计阳性对照样品，即将两个DNA片段直接连接，并通过测序确认连接效果。

四、技巧和优化1.控制DNA片段的完整性：在连接前，确保DNA片段经过正确的PCR扩增或酶切，以获得理想的DNA片段完整性。

双酶切连接反应的注意要点

双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。

因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。

有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。

3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。

酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。

4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。

5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。

6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

双酶切连接反应

双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

酶切和连接

双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。

我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。

我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。

切出了370bp左右的片段，回收载体。

然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。

证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。

50度3小时我试过，但是质粒有降解。

酶量应该说是过量的。

请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。

如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。

但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。

在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。

实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。

这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。

ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。

不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。

现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。

在瓜作用的底物。

如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。

双酶切连接反应之全攻略

双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。

2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。

3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。

二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。

2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。

3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。

4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。

一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。

5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。

6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。

三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。

合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。

2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。

3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。

同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。

4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。

同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。

5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。

四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。

双酶切连接全攻略

双酶切连接全攻略一、背景知识1.DNA序列：DNA是生物体中的遗传物质，它由四种碱基（腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)）组成的序列。

DNA的信息是以碱基的顺序编码的，其中两条互补的DNA链可以通过碱基配对形成双螺旋结构。

2.酶切：酶是一类能够催化特定化学反应的蛋白质，酶切是指通过酶的作用，将DNA序列切割成特定的片段。

3.限制性内切酶：也称为限制酶，是一类具有特异性的酶，可以识别并切割特定的DNA序列。

每种限制酶都有自己的切割位点，当DNA序列中出现与其切割位点相匹配的序列时，限制酶将在该位点切割DNA。

二、原理三、步骤1.设计引物：根据需要连接的两段DNA序列，设计引物使其能够加在两端。

引物可以通过计算机辅助设计软件进行设计，同时要确保引物与DNA序列的互补性和合适的长度。

2.DNA提取：从细胞中提取目标DNA序列，可以使用常见的DNA提取试剂盒或其他方法进行提取。

3.PCR扩增：使用引物对DNA进行PCR扩增，产生需要连接的两段DNA序列。

4.DNA酶切：根据已设计的引物，使用限制酶切割两段DNA序列。

注意选择限制酶与引物切割位点相互匹配的酶。

5.酶切后处理：将切割后的DNA片段进行凝胶电泳，用紫外线照射后可见DNA条带。

根据所需片段的大小，选择合适的片段进行提取。

6.连接反应：将两段DNA片段的黏性末端连接在一起。

可以使用商业化的连接试剂盒，也可以自行设计反应体系。

7.改造端：将连接后的DNA进行磷酸化和去磷酸化处理，加入连接酶，使连接更加稳定。

8.转化：将连接后的DNA转化到适当的宿主细胞中，例如大肠杆菌等。

9.鉴定：通过PCR扩增或其他方法对转化细胞进行检验，确认连接是否成功。

注意事项：1.引物设计要合理：引物的长度一般为18-25个碱基，其中含有5'末端的限制酶切割位点。

引物之间应避免互相重叠或互相穿插。

2.限制酶选择要合适：根据所需连接的DNA序列，选择适合的限制酶，并确保其切割位点不会干扰彼此。

双酶切的原理及应用

双酶切的原理及应用1. 前言在分子生物学和基因工程领域，DNA分子的切割是一项重要的实验操作。

传统的DNA切割方法主要采用单酶切割，即使用一种特定的限制性内切酶来切割DNA分子。

然而，有时候使用单一酶切割不够灵活或效果不好。

为了解决这个问题，科学家们提出了双酶切的方法，即同时使用两种酶来切割DNA分子。

在本文中，我们将介绍双酶切的原理及其应用。

2. 双酶切的原理双酶切的原理基于两种不同的DNA限制性内切酶对DNA分子上的特定序列进行切割。

这两种限制性内切酶在DNA分子上分别识别并切割两个不同的序列。

在双酶切实验中，首先将DNA与两种酶一起孵育，然后酶在特定序列上切割DNA，形成切割产物。

3. 双酶切的应用双酶切在分子生物学和基因工程领域有着广泛的应用。

以下是一些双酶切的常见应用：3.1 DNA片段克隆双酶切可以用于DNA片段的克隆。

在这种应用中，将目标DNA分子与两种限制性内切酶一起消化，并将两种酶的切割产物与载体DNA连接，形成重组DNA分子。

通过将重组DNA转化到宿主细胞中，可以将目标DNA片段克隆到宿主细胞中进行后续的研究。

3.2 DNA测序双酶切也可以用于DNA测序。

在传统的测序方法中，需要将目标DNA序列分割成多个小片段。

使用两种不同的限制性内切酶，可以将目标DNA序列切割成多个重叠的片段，并在测序过程中获得更加准确的序列信息。

3.3 基因组编辑双酶切在基因组编辑中也有重要的应用。

例如，CRISPR-Cas9技术就是一种常用的基因组编辑工具，它使用CRISPR与Cas9酶组合来识别和切割目标DNA序列。

通过将Cas9与另一种限制性内切酶组合使用，可以实现更精确的基因组编辑。

3.4 DNA分析双酶切也可用于DNA分析中。

比如，在基因检测中，采用双酶切可以对目标DNA中的特定基因序列进行切割，通过分析切割产物可以确定目标基因是否存在。

4. 双酶切的优势相较于单酶切，双酶切具有以下优势：•更灵活：使用两种不同的限制性内切酶，可以选择更多的切割位点，使实验更灵活多样化。

双酶切连接全攻略

双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。

现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。