双酶切及连接
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仪器、材料与试剂
• • • • • • • • • • 水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 PCR产物 SaⅡ酶 BgⅢ酶 10×H Buffer 无菌水 小离心管
实验来自百度文库程
• 质粒DNA的双酶切 反应体系:
BgⅢ SaⅡ 10× Buffer PCR产物 无菌水 总体积
0.6μL 0.6μL 2μL 10μL 0.8 μL 20μL(无菌水补至 总积)
思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些?
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
• 为什么任何时候2种酶 的总量不能超过反应 体系的1/10体积?
• 我们平时所用的酶试剂中 都含有一定量的甘油,用 量过多容易使酶产生星号 活性,即限制性酶的特异 性会受影响。
BgⅢ SaⅡ 10× Buffer 质粒 无菌水 总体积
0.6μL 0.6μL 2μL 16μL 0.8 μL 20μL(无菌水补至 总积)
反应条件:温度37℃,酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果(电泳图)
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带,质粒无条带。 • 分析:质粒无条带, 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带, 可能是酶切后DNA片 段太小,导致结果模 糊。
本组
连接
• DNA 分子的体外连接(重组)是指外源 DNA 片段和载体 DNA 分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。 • 选用一种对载体 DNA 只具唯一限制点的限 制酶,进行位点特异的切割,形成全长的 具粘性末端的线性 DNA 分子。再将外源 DNA 大片段也用同种限制酶切割,产生同 样的粘性末端。最后用 T 4 噬菌体 DNA 连 接酶能很容易地将载体与外源目的基因连 接起来。
双酶切及连接
指导老师:陈思 制作人:王鹏飞 组别:2组
目录
• • • • • • • 实验原理 仪器、材料与试剂 实验过程 结果及分析 连接 注意事项 思考题
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断,由于酶 具有专一性,一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列,所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断,进而达到定向 切割的目的。
反应体系
10× Buffer 载体 2.5μL 2μL 2μL 1μL 18.5μL
DNA T 4酶 无菌水
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时,可查 阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表,如果有一种buffer能同时使2种酶的活 力都超过70%的话,就可以用这种buffer作为反应buffer。 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份,相似 的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同 则必须分别做酶切 • 特别注意:在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近,必 须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列 的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有 的酶要求识别序列两端有多个碱基的,则必须先切,否则 就可能造成酶切失败。