双酶切实验
目的基因双酶切
目的基因双酶切
目的基因双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。
回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。
注意事项：1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干。
3、对照的设立:为验证双酶切是否成功，可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。
双酶切的优点是避免目的基因与质粒自环以及目的基因的反向连接。
双酶切的优点乎前是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接（任意桐团两点）检测目的基因是否表达出岁轮清产物，采用抗原一抗体杂交；从基因组文库获取的。
双酶切实验原理
双酶切实验原理
双酶切实验是一种用于确定DNA序列的特定区域的酶切位点
的实验方法。
它基于两个限制性内切酶共同作用于DNA分子，产生不同的酶切位点的原理。
在双酶切实验中，首先选择两个具有不同的限制性内切酶，这两个酶分别具有不同的酶切位点序列。
然后，将待检测的
DNA样品与这两个限制性内切酶一起反应，使其在特定的条
件下与DNA发生切割。
由于每个限制性内切酶在特定的酶切位点周围识别并切割DNA，因此在双酶切实验中，如果DNA序列中同时存在这两
个酶切位点，那么DNA分子将在两个酶切位点处被切割成三
个部分。
如果DNA序列中只存在其中一个酶切位点，DNA分子将在该位点处被切割成两个部分。
如果DNA序列中不存在
这两个酶切位点，DNA分子将不被切割。
实验结束后，通过电泳将不同长度的DNA片段分离出来，并
通过染色或荧光等方法可视化这些DNA片段。
通过观察
DNA片段的迁移距离和相对大小，可以确定DNA序列的特定区域是否存在以上述的两个酶切位点。
从而对DNA序列进行
分析和确认。
值得注意的是，双酶切实验的成功与否取决于待检测的DNA
序列中是否存在与所选择的限制性内切酶的酶切位点匹配的序列。
如果DNA序列中不存在所选酶切位点，DNA将不会被切割，从而无法进行相关分析和确认。
因此，在进行双酶切实验
之前，需要进行相关的DNA序列分析和预测，以确定所选酶切位点是否适用于目标DNA序列的研究。
双酶切连接反应之全攻略
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
实验5质粒DNA的双酶切
III 型酶
2种不同的亚基 2种不同的亚基 ATP、Mg2+、 EcoP1:A异性位点序 列
切割位点 序列特异性切割 在DNA克隆中的 用途
Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，
并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的 双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随 机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工 程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
特性
限制和修饰活性 蛋白质结构 辅助因子
I 型酶
单一多功能的酶 3种不同的亚基 ATP、Mg2+、 EcoB:TGANTGCT 距特异性位点至少 不是 无用
II 型酶
单一的成分 单一的成分 Mg2+ 旋转对称 位于特异性位点 是 十分有用
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末
端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末 端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TTC ……3’ 3’…… C T T|AA’G …...5’ |表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割 的位置，切割后生成两个DNA片段，各有一个单链末端， 两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合” 双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶 连接起来
制备1％琼脂糖凝胶（含 0.5μg/mLEB），120V电 泳20分钟（最高电压不超过5V/cm）。
酶切技术1
1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
酶切技术 - 限制性内切酶PCR产物的NcoI限制性内切酶酶切鉴定限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
双酶切的原理及应用
双酶切的原理及应用1. 前言在分子生物学和基因工程领域，DNA分子的切割是一项重要的实验操作。
传统的DNA切割方法主要采用单酶切割，即使用一种特定的限制性内切酶来切割DNA分子。
然而，有时候使用单一酶切割不够灵活或效果不好。
为了解决这个问题，科学家们提出了双酶切的方法，即同时使用两种酶来切割DNA分子。
在本文中，我们将介绍双酶切的原理及其应用。
2. 双酶切的原理双酶切的原理基于两种不同的DNA限制性内切酶对DNA分子上的特定序列进行切割。
这两种限制性内切酶在DNA分子上分别识别并切割两个不同的序列。
在双酶切实验中，首先将DNA与两种酶一起孵育，然后酶在特定序列上切割DNA，形成切割产物。
3. 双酶切的应用双酶切在分子生物学和基因工程领域有着广泛的应用。
以下是一些双酶切的常见应用：3.1 DNA片段克隆双酶切可以用于DNA片段的克隆。
在这种应用中，将目标DNA分子与两种限制性内切酶一起消化，并将两种酶的切割产物与载体DNA连接，形成重组DNA分子。
通过将重组DNA转化到宿主细胞中，可以将目标DNA片段克隆到宿主细胞中进行后续的研究。
3.2 DNA测序双酶切也可以用于DNA测序。
在传统的测序方法中，需要将目标DNA序列分割成多个小片段。
使用两种不同的限制性内切酶，可以将目标DNA序列切割成多个重叠的片段，并在测序过程中获得更加准确的序列信息。
3.3 基因组编辑双酶切在基因组编辑中也有重要的应用。
例如，CRISPR-Cas9技术就是一种常用的基因组编辑工具，它使用CRISPR与Cas9酶组合来识别和切割目标DNA序列。
通过将Cas9与另一种限制性内切酶组合使用，可以实现更精确的基因组编辑。
3.4 DNA分析双酶切也可用于DNA分析中。
比如，在基因检测中，采用双酶切可以对目标DNA中的特定基因序列进行切割，通过分析切割产物可以确定目标基因是否存在。
4. 双酶切的优势相较于单酶切，双酶切具有以下优势：•更灵活：使用两种不同的限制性内切酶，可以选择更多的切割位点，使实验更灵活多样化。
双酶切实验原理
双酶切实验原理双酶切实验是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA序列。
它基于限制性内切酶的特异性切割DNA的原理，结合凝胶电泳技术，可以对DNA进行特异性切割和分离，从而获得所需的DNA片段。
本文将介绍双酶切实验的原理及其操作步骤。
1.双酶切实验原理。
双酶切实验的原理基于限制性内切酶对DNA的特异性切割。
限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割的酶，它们能够将DNA分子切割成具有特定序列的片段。
在双酶切实验中，通常会使用两种不同的限制性内切酶，它们分别识别DNA的不同序列，并在这些序列上进行切割。
通过这种双酶切割的方式，可以获得具有特定序列的DNA片段。
2.双酶切实验操作步骤。
双酶切实验的操作步骤主要包括DNA提取、酶切反应、凝胶电泳和DNA可视化等步骤。
首先，需要从样品中提取DNA。
提取的DNA可以是来自细菌、动植物或其他生物体的基因组DNA，也可以是从质粒或病毒中提取的DNA。
提取的DNA需要经过纯化和定量后，才能进行后续的操作。
接下来，将提取的DNA与两种限制性内切酶和相应的缓冲液混合，进行酶切反应。
酶切反应的条件需要根据所使用的酶的特性来确定，包括反应温度、反应时间和反应缓冲液的配制等。
酶切反应完成后，需要对反应产物进行电泳分离。
在凝胶电泳中，将酶切反应产物加载到琼脂糖凝胶上，通电进行分离。
由于DNA分子在电场中具有不同的迁移速度，可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
分离完成后，可以通过染色或荧光标记等方法对DNA进行可视化。
3.双酶切实验的应用。
双酶切实验在分子生物学研究中有着广泛的应用。
它可以用于分析DNA序列的特异性，鉴定基因型、进行基因工程、构建基因库等。
通过双酶切实验，可以获得特定序列的DNA片段，为后续的克隆、测序和分析提供了重要的基础。
总的来说，双酶切实验是一种重要的分子生物学技术，它基于限制性内切酶的特异性切割原理，能够对DNA进行特异性切割和分离。
重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。
通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。
重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。
酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。
2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。
通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。
3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。
酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。
通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。
这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。
PVX204双酶切的实验方案
PVX204双酶切的实验方案
质粒PVX204的大小约为12Kb ，双酶切之后，两个片段的大小分别为约11Kb 、700bp 。
琼脂糖凝胶电泳时，胶的浓度为1.2%，必须为新配置的胶。
因为700bp 的片段较小，在电泳时，每隔15min 拍张照片，拍好的照片保存在电脑：E 盘—孔令保—PVX204。
保存的图片名称为：年—月—日—胶跑的时间，例如:2011-03-29-15min ,依次类推。
酶切体系：
酶切时，按照上面的3个酶切体系，每个酶切体系切1管，共切3管。
PVX204质粒的溶解：取一个提取的质粒的EP 管，向其中加入10μl 的灭菌水，盖上EP 管盖,过10min 后，用枪将其混匀；用枪将溶解的10μl 吸取出来加入到另一个冻干保存的PVX204EP 管中，盖上EP 管盖,过
10min 后，用枪将其混匀；用来做酶切反应。
一共要用溶解6管冻干保存的PVX204，将6管溶解成30μl ，共3个EP 管。
双酶切
反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带， 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带， 可能是酶切后DNA片 段太小，导致结果模 糊。
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查 阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活 力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似 的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同 则必须分别做酶切 • 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近，必 须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列 的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有 的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则 就可能造成酶切失败。
李婷王鹏飞王鹏飞高峰高峰实验原理实验原理用限制性内切酶去切割dna片断由于酶具有专一性一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列所以可以用特定的这种酶去切割相应的dna片断进而达到定向切割的目的
双酶切及连接
指导老师：陈思 组员：李婷 王鹏飞 高峰 姜威 邵振天
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶 具有专一性，一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向 切割的目的。
思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
双切酶实验报告
一、摘要本实验旨在探究双切酶在蛋白质消化过程中的作用，通过观察不同酶切条件下蛋白质的降解情况，分析双切酶的特异性和酶活性。
实验过程中，我们使用了胰蛋白酶和胃蛋白酶作为双切酶，通过测定酶解产物的分子量变化，得出实验结论。
二、实验目的1. 探究双切酶在蛋白质消化过程中的作用。
2. 分析双切酶的特异性和酶活性。
3. 了解酶解产物的分子量变化。
三、实验原理蛋白质在消化过程中，首先在胃中受到胃蛋白酶的作用，将其分解为较小的肽段；随后在小肠中，胰蛋白酶和胰蛋白酶原进一步分解蛋白质，最终形成氨基酸。
本实验采用双切酶（胰蛋白酶和胃蛋白酶）作用于蛋白质，观察其降解情况。
四、实验材料与仪器1. 实验材料：- 胰蛋白酶- 胃蛋白酶- 蛋白质溶液- 水浴锅- 分光光度计- 蛋白质分子量标准品2. 实验仪器：- 离心机- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 酶标仪五、实验步骤1. 配制蛋白质溶液：将蛋白质溶解于适量缓冲溶液中，调整pH值至适宜范围。
2. 分组处理：将蛋白质溶液分为四组，分别加入不同浓度的胰蛋白酶和胃蛋白酶，作为实验组；另外设置两组未加酶的蛋白质溶液作为对照组。
3. 酶解反应：将实验组和对照组溶液置于水浴锅中，在一定温度下进行酶解反应。
4. 离心分离：酶解反应结束后，将溶液离心分离，取上清液进行后续实验。
5. 蛋白质浓度测定：利用分光光度计测定各组的蛋白质浓度。
6. 蛋白质分子量测定：将各组的蛋白质溶液与蛋白质分子量标准品进行凝胶电泳，比较酶解产物的分子量变化。
六、实验现象1. 实验组蛋白质溶液的酶解程度高于对照组，说明双切酶对蛋白质具有降解作用。
2. 随着酶浓度的增加，蛋白质的降解程度也随之增加，说明酶活性与酶浓度呈正相关。
3. 不同酶对蛋白质的降解效果存在差异，胰蛋白酶和胃蛋白酶对蛋白质的降解效果较好。
七、结论与应用1. 本实验结果表明，双切酶在蛋白质消化过程中具有重要作用，能够有效降解蛋白质。
2. 酶活性与酶浓度呈正相关，因此在实际应用中，可根据需要调整酶的浓度。
质粒双酶切后成功的标志
质粒双酶切后成功的标志
质粒双酶切后成功的标志是一项重要的实验步骤，该步骤会确保质粒酶切效果良好，有助于后续的基因工程操作。
下面将详细介绍质粒双酶切成功的标志。
1.凝胶电泳分析
最常用的检测质粒双酶切成功的方法是凝胶电泳分析。
通过电泳分离DNA，可以确定DNA的长度和完整性。
在凝胶电泳中，如果双酶切割作用有效，DNA会被切成两个或多个不同大小的碎片，这些碎片会在凝胶中形成不同的带状图案。
如果没有发生双酶切割，DNA将完整地保留，形成一个单独的带状图案。
2.碱基序列分析
双酶切后的DNA片段可以被进一步分离并测序，以确保正确的酶切位点。
这被称为限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
通过与参考序列进行比较，可以确定酶切了哪些位点，并确认是否达到了预期的酶切效果。
这种方法通常在基因工程实验中使用，以确保重组质粒和转导体的正确性。
3.荧光素酶标记
质粒DNA上添加荧光素酶标记可以直接检测双酶切效果。
荧光素酶标记是一种绿色荧光蛋白，能够很容易地与DNA结合。
通过观察荧光素酶标记的荧光强度和分布，可以判断DNA是否成功双酶切割。
4.质粒测序
质粒测序是一种非常精确的检测方法。
通过使用测序仪器测量质粒双酶切后片段的每个碱基，可以确保酶切效果正确。
这种方法通常在对基因序列进行研究时使用，以确定基因在双酶切后发生的变化。
总之，质粒双酶切后成功的标志是可以通过精确的实验方法来检测，如凝胶电泳分析、碱基序列分析、荧光素酶标记和质粒测序。
这些方法可以帮助科学家确保质粒DNA的完整性和正确性，从而保证后续的基因工程操作的精确性和有效性。
双酶切实验
双酶切实验双酶切实验是一种常见的分子生物学技术，旨在通过不同特异性的限制性内切酶对DNA分子进行切割，从而得到指定的DNA序列片段，有助于进一步分析、鉴定和应用DNA分子。
本文将从实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果和分析等多方面介绍双酶切实验的具体过程和应用。
一、实验原理双酶切实验是一种分子生物学实验，其基本原理是通过限制性内切酶对DNA分子进行识别和切割，以获取所需的DNA序列片段。
限制性内切酶是一种酶，在特定的识别酶切位点中切割DNA分子，多数限制性内切酶都会切割对称型的序列，并产生黏性末端或平滑末端，这些末端能够用于DNA的连接、克隆或标记等。
双酶切实验是指利用两种或更多不同的限制性内切酶对同一个DNA分子进行切割，从而得到所需的DNA序列片段。
此时，需要将两种内切酶同时进行切割，以确保所需的DNA序列片段能够有效地被切割并分离出来，避免产生假阳性结果。
一般情况下，需要确保两种限制性内切酶不会相互重叠的切割同一段DNA序列，以避免影响实验结果的准确性。
二、实验材料1、DNA样本：需要纯度较高的DNA样本。
2、限制性内切酶：需要两种或多种不同的限制性内切酶。
3、相应的缓冲液和相关酶切盒。
4、电泳仪：实验完成后需要进行电泳检测。
5、夹心式电泳胶：用于制备凝胶板。
6、DNA分子量标准：用于校准电泳结果。
7、琼脂糖：用于制备凝胶板。
8、蒸馏水、乙醇、氯仿等：用于实验样本的获取和处理。
三、实验步骤1、制备DNA样本：需要先采集样本，并通过DNA提取试剂盒等方式获得纯度较高的DNA样本。
2、准备酶切反应体系：根据限制性内切酶的不同特性和酶切反应的需要，分别配置不同的酶切体系，并在冰箱中保存以备实验使用。
3、将DNA溶液与酶切反应体系混合：将DNA溶液与所需的酶切反应体系按比例混合，并进行酶切反应，一般需要保持恒定的温度和酶切时间来确保切割效果。
4、制备凝胶板：通过加热琼脂糖、混合等操作，制备夹心式电泳凝胶板，并在凝胶板中插入电极。
dna双酶切实验报告
DNA双酶切实验报告实验报告：DNA双酶切实验引言：DNA是生物体中的一种重要的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。
DNA双酶切是一种常用的实验技术，可以将DNA分子切成特定的片段，以便于进一步研究和分析。
实验目的：1.了解DNA双酶切技术的原理和操作步骤；2.学习如何使用限制性内切酶来进行DNA分子的切割；3.观察并分析DNA酶切产物。
实验材料：1. 限制性内切酶：如EcoR1；2.DNA样本；3.缓冲溶液；4. 质量Marker DNA。
实验步骤：1.提取DNA样本并酶切准备：a.从合适的生物材料中提取DNA样本；b.通过酶解实验，将DNA样本切割成等长片段。
2.准备酶切反应体系：a.将提取得到的DNA样本和限制性内切酶一同加入到缓冲溶液中；b.缓冲溶液包含有助于酶切反应进行的成分。
3.酶切反应：a.将酶切反应混合物加热至适宜温度，一般为37℃，使酶能够有效地发挥作用；b.反应时间根据酶的特性和所需结果而定，一般为数小时。
4.分析酶切产物：a.通过琼脂糖凝胶电泳将酶切产物进行分离；b. 将DNA样本和Marker DNA一同加载到琼脂糖凝胶孔中；c.运行凝胶电泳，使DNA片段能够迁移并被分离。
结果与讨论：观察琼脂糖凝胶电泳结果，可以看到DNA样本在电场作用下迁移，并被分离成多个片段。
根据DNA片段的大小和迁移距离，可以确定酶切产物的大小和数目。
在实验中，如果酶切产物正好与所期望的片段大小一致，则说明酶切反应成功。
若产物片段大小与预期不符，则可能由于酶切条件不恰当或酶切位点发生突变等原因。
结论：通过本实验，我们了解了DNA双酶切技术的原理和操作步骤，并成功使用限制性内切酶将DNA样本切割成特定的片段。
同时，通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们正确判断出酶切产物的大小和数目。
实验结果为我们进一步研究和分析DNA提供了基础。
总结：DNA双酶切实验是一种重要的遗传学研究手段，通过限制性内切酶的作用，可以将DNA分子切割成特定的片段，能够有效地研究和分析DNA的结构和功能。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
双酶切(1)
③双酶切处理目的片段和带有GFP的质粒并纯化一、实验原理1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。
现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH，由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术上受到广泛应用。
在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。
2.DNA的酶切反应II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。
3.DNA的连接在T4 DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。
DNA连接酶的作分三步：①T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。
②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
二、实验器材与处理方法（参照）1、限制性内切酶酶BUFFER GFP质粒2、T4 DNA连接酶连接酶缓冲液3、电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）10×电泳加样缓冲液4、溴酚蓝琼脂糖溴化乙锭（工作浓度0.5ug/ml）EcoR I5、酚氯仿无水乙醇70%乙醇灭菌双蒸水6、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）电泳仪电泳槽紫外检测仪摄影设备7、恒温水浴槽三、实验步骤先将步骤②扩增的目的片段进行纯化（柱层析或电泳割胶法）1.酶切反应（按情况加大反应体系）取GFP质粒（DNA）样品于合适的离心管中，按照表1加入试剂↓混匀；4000rpm离心30s,甩至管底↓37℃（限制性内切酶最适水温）,保温1~3h酶切（酶切过夜则建议用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多酶切体系各组分浓度改变过大，记得根据不同酶切位点加保护碱基）↓65℃，保温10-20min使限制性内切酶失活↓电泳(检测酶切反应结果)用紫外投射仪检测↓加入ddH2O （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）颠倒混匀，12000r离心10 min↓吸取上清，1/10体积3M NaAc，两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上↓12000g 4℃冷冻离心15分钟↓倒去上清，75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），质粒溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）↓继续柱纯化（Wizard少量DNA 纯化系统或碱法纯化）↓-20℃保存待用表1 酶切反应成分（单位：μl）DNA样品待定酶切缓冲液待定EcoR I 待定无菌水待定总体积待定（反应体系根据酶酶切位置确定，适当增加反应试剂）注：1、可以设置3对照一个双切（最佳缓冲液），另两个分别单切，两种先后顺序(一组正常从盐浓度低的开始切) 根据结果好坏采取恰当的操作1、双酶切可以适当延长时间，比如过夜，但可能效果也不太好；2、按次序切的话，那切完第一种酶后，跑个小样看看切的如何，切好了的话，就按照提质粒的方法纯化：a、将酶切体系补到500ul，b、然后加等体积酚：氯仿抽提一次，转移上清；c、等积极氯仿抽提一次，转移上清；d、1/10体积的3M NaOAc 和2倍体积的100%乙醇沉淀0.5~1h；e、70%乙醇洗盐；g、适当无菌水溶解；h、以溶解后的回收体积再做另一种酶切反应。
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双酶切概述
双酶切反应(Double Digests)
1、同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切
如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）
使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液
注：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“se q”标注。
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双酶切的注意事项
1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干。
3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。
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双酶切连接反应之全攻略
1、回收PCR产物：
在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15
单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA 约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1，000，000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用M ARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa 段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。
连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。
时间3个小时足已。
3、转化：
a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热90秒钟后，再在冰中放置2分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。
也可离心后余100μl
几个非常重要的问题
1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度.
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干
3对照的设立：
为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.
如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时，也要进行对照.设4个：
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基，连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒，图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。
然后双酶切鉴定，测序。