酶切

粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TT_C ……3’
3’…… C_TT|AA’G …… 5’
垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC 或 CTTAAG ，这就是回文顺序（ palindrome ）。 _ 和 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成 5’……G 和 AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一 个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以 及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
（3）反应缓冲液
购买商品限制酶时，一般生物公司产 品手册均有各种酶最适放映缓冲液的资料 可查询。要注意其离子浓度、PH等.
（4）酶切温度及时间
大多数限制酶的反应温度为37℃，酶 切反应时间一般为1~1.5h。
（5）反应体积
（6）器材处理
酶切实验所用器材均需高压灭菌，实 验中用镊子夹取，放置手上杂酶污染。
(2) 酶切消化反应的温度
大多数常用反应温度为37℃，相当一 部分酶在反应温度升高时活力不稳定。如 EcoRⅠ,在 42 ℃就被灭活，而少数酶在高 于37℃市活力升高，例如SfiⅠ在50 ℃是酶 活力为37℃的5倍。另有一些酶需要在低于 37℃下反应，如SmaⅠ，最适反应温度在 25 ℃左右。
（3）反应体积
同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产 生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶， 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但 原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生 一个新的酶切位点。如Xba1、Nhe1以及Spe1 切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG” 粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶 将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸 的酶切位点，即 Bfa1的酶切位点。
（7）终止反应
酶切后有3中方法终止反应：1）一般 65 ℃10~15min可灭活内切酶。2）加入 EDTA螯合限制辅助因子Mg2+终止反应。 注意：如果酶切反应后还要进行其他酶反 应（如连接酶等），不得使用EDTA终止反 应。3)用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，纯化酶 切产物。
6、内切酶实验注意事项
（1）限制酶 选用高质量的酶制剂，使之不含有外 切酶等杂酶活性。注意保持内切酶的活性， 将酶从低温冰箱中取出后应立即置于事先 准备好的冰浴中，用后立即放回低温冰箱。
（2）底物DNA
底物纯度要高，不能含有RNA，蛋白 质或含量极少，液不能含有过高的EDTA、 SDS等去污剂及过量的盐离子浓度，更不 能有酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。
平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’
切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来。
1、寄主控制的限制与修饰现象 2、核酸限制性内切酶的类型及基本特性
3、 同裂酶和同尾酶
4、 核酸限制性内切酶的命名法
5、影响核酸限制性内切酶活性的因素
6、内切酶实验注意事项
1、寄主控制的限制与修饰现象
限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段， 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细 胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合 成了一至两种修饰酶（甲基化酶） ，对自身 的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制 的限制与修饰现象。
（5）反应时间
由于以商品提供的内切酶都是相对纯 的制剂，只是在所用检测条件下未显示杂 酶活力，并不是绝对不含其它杂酶，若反 应时间过长，有可能出现杂酶活力。因此， 在使用时要避免长时间的酶解反应，一般 可选择1~1.5h的时间，最长不要超过3h。
（6）DNA分子自身
酶单位规定为：在最适反应条件下 1h完全消化1μg λDNA的酶量为一个单位， 需注意的是酶单位数是以切割线性 DNA 为标准定出的，消化其它种类的 DNA则 应根据DNA分子的大小、形状等适当增 加或减少所需酶量。
II型
此型限制酶能识别专一的核苷酸顺序，并 在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类 限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一 的。因此，这种限制性内切酶是 DNA 重组技术 中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核 苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也 有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和 11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺 序是一个二重对称的回文序列。这种酶的切割 可以有两种方式：
III型
III型限制性内切酶也有专一的识别顺
序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁 边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。 但这几个核苷酸对不是特异性的。因此， 这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应 用于基因克隆。
内切酶以双链DNA做底物，需要镁离子做辅 助因子，有特异的识别序列，但不同的酶也有许 多差别，见下表 I型
切割位点 非特定，识 别序列前后 100~1000bp 范围内 有 ATP、SAM 大 小
II型
特定，识别 序列中或近 处 无
III型
特定，识别 序列3’端 25~27bp处 有 ATP 大
甲基化作用 辅助因子 分子量
3、 同裂酶和同尾酶
同裂酶：
有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序 和切割位置都相同，有时其差别只在于当 识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限 制性内切酶可以切割，另一种则不能。例 如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是 5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞 嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同 切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工 酶）。
DNA的酶切鉴定
唐利
医学实验中心
实验目的和要求
1、学习和掌握限制性内切酶的特性及 酶切原理 2、熟悉限制性内切酶实验的注意事项 3、了解限制性内切酶是DNA重组技术 的关键工具。
相关基础知识
限制性核酸内切酶：是一类能识 别 双 链 DNA 分 子 特 异 性 核 酸 序 列 的 DNA 水解酶。是体外剪切基因片段的 重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工 具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA 重组中重要的工具，而且还可以用于 基因组酶切图谱的鉴定。
例如流感嗜血杆菌中3个酶的命名：
酶的来源 Haemophilus 属名 酶的名称 influenzae 种名 Hind Ⅰ HindⅡ HindⅢ d 株系 特异性甲基化酶 ↓ GTPy PuAC ↓ A AGCTT
பைடு நூலகம்
5、影响核酸限制性内切酶活性的 因素
（1）DNA的纯度及 DNA的甲基化程 度
DNA甲基化、附有蛋白质或高分子 量DNA胶体溶液太黏稠均会降低内切酶 的、消化效率。
酶反应体积一般不宜小于20l，因为过 小的反应体积在加入各种成分时易产生误 差，甘油含量易超过5%，会抑制内切酶活 性。在37 ℃保温可因水分蒸发而明显改变 反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活 力。但反应体积过大，酶浓度变小，底物 浓度太低，同时要考虑反应完毕进行电泳 时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显 出清晰的谱带。
2、限制性核酸内切酶的类型及特 性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
I型
该限制性内切酶能识别专一的核苷酸 顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切 割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。这类限制性 内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处 不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
（4）缓冲液中离子浓度
不同的限制酶多缓冲液中盐浓度的要 求各不相同。一般配置高、中、低3中缓冲 液用于限制酶反应。用两种酶消化DNA， 若各种酶所需盐浓度相同时，消化可同时 进行；若需要的盐浓度不同，则必须先用 低盐浓度的限制酶消化完成后，再调整到 高盐缓冲系统，加入需高盐浓度的内切酶 继续消化。
4、限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个大写字母和种名的头两个 小写字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。