酶切

同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产 生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶， 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但 原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生 一个新的酶切位点。如Xba1、Nhe1以及Spe1 切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG” 粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶 将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸 的酶切位点，即 Bfa1的酶切位点。
6、内切酶实验注意事项
（1）限制酶 选用高质量的酶制剂，使之不含有外 切酶等杂酶活性。注意保持内切酶的活性， 将酶从低温冰箱中取出后应立即置于事先 准备好的冰浴中，用后立即放回低温冰箱。
（2）底物DNA
底物纯度要高，不能含有RNA，蛋白 质或含量极少，液不能含有过高的EDTA、 SDS等去污剂及过量的盐离子浓度，更不 能有酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。
(2) 酶切消化反应的温度
大多数常用反应温度为37℃，相当一 部分酶在反应温度升高时活力不稳定。如 EcoRⅠ,在 42 ℃就被灭活，而少数酶在高 于37℃市活力升高，例如SfiⅠ在50 ℃是酶 活力为37℃的5倍。另有一些酶需要在低于 37℃下反应，如SmaⅠ，最适反应温度在 25 ℃左右。
（3）反应体积
（3）反应缓冲液
购买商品限制酶时，一般生物公司产 品手册均有各种酶最适放映缓冲液的资料 可查询。要注意其离子浓度、PH等.
（4）酶切温度及时间
大多数限制酶的反应温度为37℃，酶 切反应时间一般为1~1.5h。
（5）反应体积
（6）器材处理
酶切实验所用器材均需高压灭菌，实 验中用镊子夹取，放置手上杂酶污染。
（4）缓冲液中离子浓度
不同的限制酶多缓冲液中盐浓度的要 求各不相同。一般配置高、中、低3中缓冲 液用于限制酶反应。用两种酶消化DNA， 若各种酶所需盐浓度相同时，消化可同时 进行；若需要的盐浓度不同，则必须先用 低盐浓度的限制酶消化完成后，再调整到 高盐缓冲系统，加入需高盐浓度的内切酶 继续消化。
DNA的酶切鉴定
唐利
医学实验中心
实验目的和要求
1、学习和掌握限制性内切酶的特性及 酶切原理 2、熟悉限制性内切酶实验的注意事项 3、了解限制性内切酶是DNA重组技术 的关键工具。
相关基础知识
限制性核酸内切酶：是一类能识 别 双 链 DNA 分 子 特 异 性 核 酸 序 列 的 DNA 水解酶。是体外剪切基因片段的 重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工 具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA 重组中重要的工具，而且还可以用于 基因组酶切图谱的鉴定。
II型
此型限制酶能识别专一的核苷酸顺序，并 在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类 限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一 的。因此，这种限制性内切酶是 DNA 重组技术 中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核 苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也 有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和 11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺 序是一个二重对称的回文序列。这种酶的切割 可以有两种方式：
酶反应体积一般不宜小于20l，因为过 小的反应体积在加入各种成分时易产生误 差，甘油含量易超过5%，会抑制内切酶活 性。在37 ℃保温可因水分蒸发而明显改变 反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活 力。但反应体积过大，酶浓度变小，底物 浓度太低，同时要考虑反应完毕进行电泳 时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显 出清晰的谱带。
4、限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个大写字母和种名的头两个 小写字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 源自文库’
切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来。
粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TT_C ……3’
3’…… C_TT|AA’G …… 5’
垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC 或 CTTAAG ，这就是回文顺序（ palindrome ）。 _ 和 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成 5’……G 和 AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一 个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以 及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
1、寄主控制的限制与修饰现象 2、核酸限制性内切酶的类型及基本特性
3、 同裂酶和同尾酶
4、 核酸限制性内切酶的命名法
5、影响核酸限制性内切酶活性的因素
6、内切酶实验注意事项
1、寄主控制的限制与修饰现象
限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段， 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细 胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合 成了一至两种修饰酶（甲基化酶） ，对自身 的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制 的限制与修饰现象。
切割位点 非特定，识 别序列前后 100~1000bp 范围内 有 ATP、SAM 大 小
II型
特定，识别 序列中或近 处 无
III型
特定，识别 序列3’端 25~27bp处 有 ATP 大
甲基化作用 辅助因子 分子量
3、 同裂酶和同尾酶
同裂酶：
有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序 和切割位置都相同，有时其差别只在于当 识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限 制性内切酶可以切割，另一种则不能。例 如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是 5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞 嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同 切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工 酶）。
III型
III型限制性内切酶也有专一的识别顺
序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁 边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。 但这几个核苷酸对不是特异性的。因此， 这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应 用于基因克隆。
内切酶以双链DNA做底物，需要镁离子做辅 助因子，有特异的识别序列，但不同的酶也有许 多差别，见下表 I型
2、限制性核酸内切酶的类型及特 性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
I型
该限制性内切酶能识别专一的核苷酸 顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切 割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。这类限制性 内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处 不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
（7）终止反应
酶切后有3中方法终止反应：1）一般 65 ℃10~15min可灭活内切酶。2）加入 EDTA螯合限制辅助因子Mg2+终止反应。 注意：如果酶切反应后还要进行其他酶反 应（如连接酶等），不得使用EDTA终止反 应。3)用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，纯化酶 切产物。
（5）反应时间
由于以商品提供的内切酶都是相对纯 的制剂，只是在所用检测条件下未显示杂 酶活力，并不是绝对不含其它杂酶，若反 应时间过长，有可能出现杂酶活力。因此， 在使用时要避免长时间的酶解反应，一般 可选择1~1.5h的时间，最长不要超过3h。
（6）DNA分子自身
酶单位规定为：在最适反应条件下 1h完全消化1μg λDNA的酶量为一个单位， 需注意的是酶单位数是以切割线性 DNA 为标准定出的，消化其它种类的 DNA则 应根据DNA分子的大小、形状等适当增 加或减少所需酶量。
例如流感嗜血杆菌中3个酶的命名：
酶的来源 Haemophilus 属名 酶的名称 influenzae 种名 Hind Ⅰ HindⅡ HindⅢ d 株系 特异性甲基化酶 ↓ GTPy PuAC ↓ A AGCTT
5、影响核酸限制性内切酶活性的 因素
（1）DNA的纯度及 DNA的甲基化程 度
DNA甲基化、附有蛋白质或高分子 量DNA胶体溶液太黏稠均会降低内切酶 的、消化效率。