实验六-酶切
本科生六个基本生物学实验
实验一：感受态细胞的制备1.原理：当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。
转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。
一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。
然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。
这一方法是分子生物学常用实验方法。
2.实验材料2.1LB液体培养基2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。
2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）；移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱3.操作方法3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。
次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。
3.2自该步骤起皆需无菌操作。
在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。
3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。
3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。
3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。
3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。
3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒酶切反应实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。
2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。
二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。
限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。
本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。
（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。
（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。
（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。
（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。
（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。
（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。
（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。
2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。
（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。
（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。
（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。
实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。
切fc标签的酶切位点
切fc标签的酶切位点1.引言1.1 概述概述部分的内容可以围绕以下几个方面展开：酶切位点是指在DNA或RNA分子中，由特定的酶所识别并切割的特定序列。
在分子生物学研究中，酶切位点起着至关重要的作用，能够帮助科学家们进行基因工程，提供了许多重要的实验手段。
酶切位点的作用主要有两个方面。
首先，酶切位点可以用于在DNA或RNA分子中特定的位置进行切割，从而产生特定的断裂端。
这种切割作用可以用于插入或删除特定的DNA或RNA片段，为进行基因工程提供了便利。
其次，酶切位点还可以用于识别和验证目标分子的存在。
通过在特定的酶切位点上进行酶切反应，可以判断目标分子是否具有所需的序列。
这种酶切位点的验证方法被广泛应用于基因测序、基因突变分析等研究领域。
在切fc标签的酶切位点中，"fc"是指结合蛋白A或蛋白G的抗体Fc 区域，在蛋白质表达和纯化中起到了重要的作用。
通过选择合适的酶切位点，可以方便地将fc标签与目标蛋白连接起来或切割开来，实现对目标蛋白的定位和纯化。
目前，常用的切fc标签的酶切位点主要包括六个，分别是TEV (tobacco etch virus) 蛋白酶切割位点，HRV 3C (human rhinovirus) 蛋白酶切割位点，Factor Xa (FXa) 蛋白酶切割位点，Enterokinase (EK) 肠激酶切割位点，Thrombin (Thr) 血凝酶切割位点，和MCP (mousecarboxypepti-dase) 鼠卡糖肽酶切割位点。
以上是关于切fc标签的酶切位点的概述部分的内容。
接下来文章将进一步介绍这些酶切位点的定义和作用，并探讨它们在实验研究中的应用。
文章结构部分的内容应该包括本文的章节划分和每个章节的主要内容概述。
具体可以编写如下内容：文章结构：本文按照以下章节进行展开：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 酶切位点的定义和作用2.2 常用的切fc标签的酶切位点3. 结论3.1 总结3.2 展望下面将对每个章节的主要内容进行概述：1. 引言：引言部分将对本文的研究背景和意义进行概述，并介绍酶切位点在分子生物学研究中的重要性。
酶切注意事项及问题
1、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。
关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。
使用时的缓冲液浓度应为1X。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。
其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。
然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。
酶切注意事项及问题
一、建立一个标准得酶切反应ﻫ目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位得内切酶可以切割1μg不同来源与纯度得DNA。
通常,一个５0μｌ得反应体系中,１μｌ得酶在1X NEＢｕffer终浓度及相应温度条件下反应１小时即可降解1μｇ已纯化好得DNA。
如果加入更多得酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶得用量,对许多酶来说,相应延长反应时间(不超过1６小时)也可完全反应。
ﻫﻫ二、选择正确得酶不言而喻，选择得酶在底物DＮＡ上必须至少有一个相应得识别位点。
识别碱基数目少得酶比碱基数目多得酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量5０%得DＮA链,一个识别4个碱基得酶将平均在每4４(256）个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基得酶将平均在每46(40９6)碱基切割一次。
内切酶得产物可以就是粘端得(3’或5’突出端),也可以就是平端得片段。
粘端产物可以与相容得其它内切酶产物连接，而所有得平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录得pａtible Cohesivｅ Eｎdｓ And Reｃｌｅaｖa ｂle Ｂｌunt Eｎｄs一文。
ﻫ三、酶ﻫ内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当就是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有得其它反应物都应当已经加好并已预混合)。
酶得用量视在底物上得切割频率而定。
例如,超螺旋与包埋法切割得DNＡ通常需要超过1U/μｇ得酶才能被完全切割。
参见目录第244与２64之"切割质粒DNA"与＂包埋法切割DNA"。
ﻫ四、ＤNA待切割得ＤＮA应当已去除酚、氯仿、乙醇、ＥDTA、去污剂或过多盐离子得污染,以免干扰酶得活性。
DＮA得甲基化也应该就是酶切要考虑到得因素。
关于甲基化得内容，参见第252页至25３页之甲基化相关内容。
五、缓冲液对于每一种酶ＮEB都提供相应得最佳缓冲液,可保证几乎１00％得酶活性。
使用时得缓冲液浓度应为1X。
有得酶要求１0０μg/mｌ得BSA以实现最佳活性。
实验六 质粒DNA的提取与酶切
实验六质粒DNA的提取与酶切姓名：mangogola质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行复制，并使子代细胞保持他们恒定的拷贝数。
目前质粒已广泛用于DNA分子无性繁殖的运载体，同时也是研究DNA结构和功能的较好模型。
质粒一般来自细菌，分离和纯化的方法有很多但都包括以下几个步骤：细菌培养和质粒扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。
细菌裂解时常用溶菌酶和SDS或氢氧化钠和SDS的混合物作为裂解液，这样染色体DNA可以形成折叠状结构附着在细胞膜碎片上，离心时容易沉出，质粒DNA存在于上清液中，其中还含有可溶性蛋白和RNA等，用蛋白酶或核糖核酸酶使他们降解，通过碱性酚和氯仿-异戊醇混合液抽提除去蛋白等杂质。
质粒的酶切使用限制性内切酶，它是一类识别双链DNA中特殊核苷酸序列并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内切脱氧核糖核酸酶。
限制性内切酶产生的DNA片段末端有两种形式：粘性末端和平齐末端。
影响限制性内切酶作用效率的影响因素有：DNA甲基化、DNA 纯度、酶用量、反应温度以及反应的缓冲体系等等。
一．实验过程1.细菌培养无菌条件下用接种环挑取少量冻结的菌种接到平皿上（可平板划线分离单菌落），37℃培养8-12h。
用牙签挑取单菌落接入含有氨苄青霉素溶液的液体培养基中，封口，37℃振荡培养6-12h。
2.碱裂解法提取质粒DNA连续取1ml菌体两次通过离心累积至一个EP管中。
将细菌沉淀重悬于100uL预冷的溶液Ⅰ中，振荡器上剧烈震荡混匀。
加入200uL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒混匀5次，不要震荡，将离心管置于冰上5min。
加入150uL预冷的溶液Ⅲ盖紧管口，倒置后温和震荡10s，之后将离心管置于冰上3-5min。
4℃,12000g离心5min，上清液转移至一新管中。
加入等量的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，震荡1-2min。
4℃,12000g离心2min，上清液转移至一新管中。
生化大实验实验步骤(实验6,7,8)
实验六、质粒酶切及电转化毕赤酵母一、实验原理及目的核酸不能自动进入细胞，需要协助才能穿过细胞壁的物理屏障进入能够进行表达或复制的胞内位点。
电流可逆性的击穿细胞膜形成瞬时水通路或膜上小孔，促使DNA分子进入胞内。
电场强度为kV/ cm、持续时间为μs —ms 级的电脉冲刺激会使细胞膜发生电穿孔现象,即:细胞膜结构重组,出现微孔,电导率改变,暂时丧失屏障功能等,从而引起离子的流出, 代谢物的排泄, 细胞对药剂及DNA 等大分子的吸收量增加。
线性DNA分子与环状DNA分子均可用于转染，但线性DNA无论是瞬时表达还是稳定转染的水平高于环状分子。
所以对于闭合环状的质粒DNA来说，要首先利用限制性内切酶切割使其变成线性分子，然后进行转染。
同时转染的效率还会以下因素影响：外加电场的强度、电脉冲的长度、温度、培养基的离子成分。
掌握电穿孔转染DNA技术。
二、材料和试剂RDB培养基 1、取Sorbitol 18.6g 及琼脂 3 g 溶于70ml水中。
2、10Х D 10ml （8g葡萄糖，40mlDDW）X3 灭菌110℃ 15min10 YNB 10ml （13.4gYNB 100mlDDW 过滤除菌） 500Х B 0.2ml ( 2mg 生物素，10ml水，过滤除菌) 100Х AA 1.0ml （过滤除菌）DDW 8.8ml将1、2 两种溶液混合，加热后倒平板，每个平板10ml.共10个平板。
I、线性化质粒的制备SacI酶切质粒3小时酶切体系（根据质粒浓度而定，保定质粒浓度DNA大于1μg/μl）DDW 16.5μlBufferI 2.5μl质粒 5μlSacI 1μl跑胶回收质粒II、酵母感受态细胞的制备：1、按1：100将300μl保种菌接种于3mlYPD培养基中30℃揺菌过夜（约15h）2、取活化的菌液50μl接入50mlYPD液体培养基30℃揺菌过夜，至OD600=1.3-1.5（12-15h），收集菌体制备感受态细胞。
现代分子生物学实验重点
现代分子生物学实验考试复习重点一．判断题1.Maker(分子量标准)在DNA电泳中起荧光染料（对照）的作用。
（错）2.用作DNA片段克隆的载体除质粒外，还有噬菌体和人工染色体等。
（对）3.PCR扩增的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
（对）4.碱变性发提取质粒是根据碱性条件下染色体DNA 不变性（变性）而质粒DNA变性（不变性）的原理。
（错）5.基因工程中常用的限制性内切酶可对DNA进行特异性的识别和切割。
（对）6.用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般为限制-修饰系统缺陷的变异株。
操作中需要无菌、低温且动作要轻柔。
（对）7.大肠杆菌转化过程中，细菌在LB液体培养基中进行恢复培养时，（不）应添加相应的抗生素。
（错）8、转化中的蓝白颜色筛选，在LB固体培养基的平皿中添加IPTG的作用是作为β-半乳糖苷酶作用的底物（诱导）。
（错）X-Gal为生色底物。
9.CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可破坏细胞膜，当低离子强度的溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不（可以）能沉淀核酸，因此将核酸与蛋白质等细胞内容物分开。
（错）高离子强度的溶液不能沉淀核酸。
10.一般可以用异丙醇和乙醇沉淀DNA和RNA。
（对）二．问答1.PCR实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。
PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
反应分为三步：1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。
DNA的限制性酶切实验原理
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
23
Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其 杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的 强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
trypsin 酶切原理
trypsin 酶切原理一、前言酶切是生物学中一项重要的技术，它能够将蛋白质分解成小片段，从而方便进行后续的研究。
其中，trypsin 酶是常用的一种酶切剂。
本文将详细介绍 trypsin 酶的原理。
二、trypsin 酶的定义trypsin 酶是一种消化酶，在胰脏和肠道中均有存在。
它能够将蛋白质分解成氨基酸和小肽链。
三、trypsin 酶的结构trypsin 酶是一种蛋白质，由 223 个氨基酸组成。
它包括一个 N 端、一个 C 端和一个活性位点。
N 端和 C 端之间有两个互相连接的链，形成了一个环状结构。
四、trypsin 酶的活性位点trypsin 酶的活性位点包括三个氨基酸：His57、Asp102 和 Ser195。
这三个氨基酸组成了一个催化三角形，能够有效地水解蛋白质。
五、trypsin 酶的作用机制当 trypsin 酶与蛋白质结合时，它会将蛋白质切割成小片段。
具体来说，trypsin 酶会将蛋白质的肽键切割成两个氨基酸。
这个过程需要trypsin 酶的活性位点发挥作用。
在 trypsin 酶的活性位点中，His57 能够吸引一个氢离子（H+），从而使 Asp102 成为一个更好的亲核试剂。
同时，Ser195 会形成羟基离子（OH-），这个羟基离子能够攻击蛋白质的肽键，从而将其切割成两个氨基酸。
六、trypsin 酶的适用范围由于 trypsin 酶能够将蛋白质分解成小片段，因此它在生物学研究中有着广泛的应用。
例如，在蛋白质结构研究中，科学家们常常使用trypsin 酶将蛋白质分解成小片段，然后通过对这些小片段进行分析，来了解整个蛋白质的结构和功能。
七、trypsin 酶与其他酶切剂的比较与其他酶切剂相比，trypsin 酶具有以下优点：1. trypsin 酶的切割效率高，能够将蛋白质迅速分解成小片段。
2. trypsin 酶的适用范围广，能够切割多种类型的蛋白质。
3. trypsin 酶的成本较低，易于购买和使用。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
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四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
dna片段酶切加样顺序
dna片段酶切加样顺序DNA片段酶切加样顺序一、引言DNA片段酶切是分子生物学研究中常用的技术手段之一，它可以将DNA分子切割成特定的片段，为后续的DNA分析和操作提供了基础。
而DNA片段酶切加样顺序则是进行DNA酶切实验时需要注意的一种步骤顺序。
本文将结合DNA片段酶切实验的步骤，按照加样顺序进行详细介绍。
二、样品准备在进行DNA片段酶切实验前，首先需要准备待酶切的DNA样品。
样品可以是从细胞中提取的总DNA，也可以是经过PCR扩增得到的特定DNA片段。
样品提取的关键是保证DNA的完整性和纯度，以确保酶切反应的准确性和可重复性。
三、酶切酶选择在进行DNA片段酶切实验时，需要选择适合的酶切酶。
常用的酶切酶有限制性内切酶，它能够识别特定的DNA序列并在其特定位置切割DNA分子。
根据实验的需要，选择适合的内切酶切割DNA 样品。
四、酶切缓冲液配制酶切缓冲液是进行DNA片段酶切反应必不可少的一种溶液。
它能够提供适宜的酶切环境，维持酶的活性。
酶切缓冲液的配制需要根据所选择的酶切酶来确定，通常包含适当的离子浓度、pH值和辅助剂。
五、酶切反应的进行1. 加入DNA样品：将待酶切的DNA样品加入酶切反应管中。
根据实验需要，可以加入不同浓度的DNA样品。
2. 加入酶切酶：将选择的酶切酶加入酶切反应管中，与DNA样品发生特异性的酶切反应。
酶切酶的用量应根据厂家提供的建议或实验室经验来确定。
3. 加入酶切缓冲液：将事先配制好的酶切缓冲液加入酶切反应管中，使酶切反应在适宜的条件下进行。
六、酶切反应的条件控制1. 反应温度：根据所选择的酶切酶的工作温度范围，在恒温设备中将反应温度设定为适宜的温度。
2. 反应时间：酶切反应的时间可以根据实验需要进行调整。
通常，酶切反应时间不宜过长，以避免DNA降解导致结果失真。
3. 混匀条件：酶切反应进行时，需要对反应体系进行充分的混匀，以保证酶切反应均匀进行。
七、酶切反应停止酶切反应停止的目的是阻止酶切酶的活性，以保持酶切产物的稳定性。
质粒DNA的限制性酶切
实验六 质粒DNA的限制性酶切鉴定 质粒DNA的限制性酶切鉴定
【实验目的】 实验目的】
学习通过限制性酶切法签定阳性克隆的方 法原理与技术。
【实验原理】 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的 基本工具。限制酶特异性地结合于一段被 称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内 称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内 或其附近的特异位点上，并在此切割双链 类限制酶，其 识别位点长度为4 识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重 复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些 产生带平端的DNA片段，而另一些产生带 产生带平端的DNA片段，而另一些产生带 有粘性末端的DNA。 有粘性末端的DNA。
pUC18/19酶切位点的分布示意图
【实验仪器与试剂】 实验仪器与试剂】
一、实验仪器 1、微量移液器 2、离心机 3、恒温水浴箱 二、试剂 1、Pst-I Pst2、ddH2O
【实验步骤】 实验步骤】 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 体积（µ 体积（µl） 7 2 10 1 20
反应物 DW 10×Buffer 10× 质粒DNA 质粒DNA PstPst-I 总计
2、将反应物置于37℃水浴，温浴1～3小 、将反应物置于37℃水浴，温浴1 时。 3、加入5 µl加样缓冲液，混匀后即可加样 、加入5 进行电泳。 4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。
【思考题】 思考题】 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的 反应效率？ 3、如何设置酶切反应的对照？
DNA 酶切、回收和连接
⑥ 置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时， 酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸 发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大; ⑦ 置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不 同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行; ⑧ 进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果; ⑨ 反应体系： 10×内切酶缓冲液 DNA 限制性内切酶 2µl 1-1.5µg 2-5单位
Hale Waihona Puke 用灭菌的ddH2O补至20µl，37℃ 1小时。可根据需要 按比例放大。
pGFPuv和pBSK的酶切体系 pGFPuv和pBSK的酶切体系： 的酶切体系：
酶切体系 10×RE buffer (E) 100×BSA DNA EcoR I Hind III ddH2O 质粒载体（pGFPuv和pBSK） 6 µl 0.6 µl 6 µg 0.6 µl 0.6 µl X µl → 合计60 µl
双酶切buffer的选用
〈二〉实验器材
1．电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备 2．恒温水浴槽
四. 操作步骤
1. 酶切反应 ① 设计酶切体积为20~30µl，计算清楚酶切系统中各成 分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多 个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装； ② 先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10x 酶切缓冲液，混匀； ③ 在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶； ④ 加入适量的DNA样品； ⑤ 弹匀，短暂离心；
• 影响限制性内切酶活性的生物因子： 影响限制性内切酶活性的生物因子： 5. 内切酶用量不超过总反应体积的10%； 6. 消化时间适当延长有利于提高酶活性； 7. 加DNAse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用； 8. 用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性； 9. 酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用； 10.DNA样品应不含重金属离子。
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五、利用限制性内切酶克隆
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设
计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同 酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸 露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加 上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对 其识别位点进行有效切断。 酶切位点（内切酶的识别序列）要加在引物的 5‘端 具体为：5'-保护碱基+酶切位点+引物序列-3'
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进
一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先 使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后臵-70℃低温 冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶 切反应。
割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
第二类内切酶
酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸
识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴
同尾酶；切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的 一类限制性内切酶。
这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相
同的粘性末端。 由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补 作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限 制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在， 不能被原来的限制性内切酶所识别。
双酶切
同步双酶切 分步酶切
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶
切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要 求，然后加入第二种酶完成双酶切反应
操作注意事项
1.吸样量一定要准确
2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶
3.要求在冰上操作，并充分混匀，
4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防 污染。
二、限制性内切酶类型
第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附
近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的 核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位臵上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别 和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸 顺序的DNA片段。 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文 顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位臵上切
同裂酶；有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷
酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可 能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶， 识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。
三、酶切效率影响因素
DNA纯度
缓冲液性内切酶不受RNA或单链DNA的影响
5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进 入管内造成实验失败。
限制性内切酶酶解中常见的问题 和原因
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失
活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限 制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不 存在该酶的识别顺序。 2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正 确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部 分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。 3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力； ②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它 DNA。
失活以终止反应。
4、12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。 5、取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖 6、结果观察
凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约 100V30 ～ 60min 。
酶切反应体系(50μl)
模板DNA：5μl 限制性内切酶10×Buffer：10μl (2×) 酶：各0.5 μl 去离子水：34 μl
不完全酶切
2000bp 1000bp 750bp
完全酶切
2000bp 1000bp 750bp 500bp
Marker-PUM 2686bp 2050bp 1507bp
周二
1119bp
878bp 500bp
周三
周三
周五
2692bp+800bp=3492bp 3492bp*0.7=2444bp
周五
目标片段
2000bp 1000bp 750bp 500bp
酶切验证
23.1kb 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb 2.0kb 2692bp
实验六、酶切
一、限制性内切酶酶切实验原理
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一
种内切核酸酶。一般是在原核生物中发现，它可 以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入，但对自己的 DNA却无损害作用。由于这 种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，在DNA片段的5’端为P，3’端为OH。
pMD®18-T Vector的结构
酶切技术
重组质粒DNA插入片段800bp 本实验所用限制性核酸内切酶为BamH I和Hind
III
磷酸二脂键断裂
酶切反应步骤
1、酶切体系的配备
在一无菌1.5ml Eppendorf管中加入 轻轻混匀，12000rpm离心5sec。
2、37℃水浴1h。 3 、将 Eppendorf 管臵 65℃ 水浴中 10min ，通过加热使酶