实验 质粒DNA的酶切
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
质粒酶切反应实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。
2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。
二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。
限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。
本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。
（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。
（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。
（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。
（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。
（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。
（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。
（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。
2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。
（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。
（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。
（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。
质粒DNA的酶切和PCR
发现使PCR技术能够广泛地应用于各个相关
领域。
• 平常放负20℃保存，用时候放在冰上。
质粒DNA的酶切实验步骤
• 酶切体系(20ul)
DNA（质粒） 8.0 ul
10×Buffer 2.1 2.0 ul
EcoRI
0.5 ul
BamHI
0.5 ul
ddH2O
9.0 ul
20ul 5 ul × 10 体系 5 ul 90ul
实验说明
• EcoRⅠ是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一 个限制酶,酶切序列为 ,形成黏性末端。
• BamHⅠ由淀粉芽孢杆菌产生,它也是一种限
制酶，酶切序列为5' G^GATCC 3‘ 3' CCTAG^G5'
,
形成黏性末端。
• Taq酶即DNA聚合酶，是来源于高温嗜热菌，
其最大的特点就是高温下不失活，Taq酶的
每管12.0 ul分装
加完体系后，将离心管放入水浴锅37℃， 3h左右即可。
PCR体系和程序
PCR体系（20ul）
DNA（质粒）
1.0 ul
ddH2O 引物（M13 F） 引物（M13 R）
dNTP 10×PCR Buffer Mg2+（MgCl2） Taq酶 (最后加)
14.0 ul 0.5 ul 0.5 ul
实验二：质粒DNA的酶切和PCR
2015.11.10
• 1 酶切原理 • 2 PCR原理 • 3 实验说明 • 4 注意事项
酶切原理
质粒DNA
酶切
PCR原理
• 聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction，简 称PCR）。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分 子生物学技术，可看作生物体外的特殊DNA复制，PCR的 最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
酶切检测实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握限制性核酸内切酶（RE）的原理及其在分子生物学中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习并实践质粒DNA的酶切技术。
4. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用。
5. 分析酶切结果，鉴定目的基因。
二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一类能够识别特定的DNA序列并在该序列处切割双链DNA的酶。
它们在分子生物学中具有广泛的应用，如基因克隆、基因编辑、基因表达调控等。
质粒DNA是常用的克隆载体，其提取方法主要有碱裂解法、盐析法等。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
酶切是将质粒DNA切割成大小不同的片段，通过琼脂糖凝胶电泳技术分离这些片段，从而鉴定目的基因。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术，其原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率差异进行分离。
在电场作用下，DNA分子带负电荷，会向正极移动。
DNA分子的大小与其迁移速率成反比，因此，通过比较不同片段的迁移距离，可以鉴定DNA片段的大小。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（RE）3. 琼脂糖凝胶4. TAE缓冲液5. DNA marker6. 电泳仪7. 显色剂8. 紫外灯四、实验步骤1. 质粒DNA提取- 将含有质粒DNA的菌液接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。
- 取适量菌液，加入等体积的碱裂解液，混匀，室温放置5分钟。
- 加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。
- 加入700 μL 70%乙醇，混匀，室温放置5分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。
- 加入50 μL无菌水，混匀，即得质粒DNA。
2. 酶切- 取10 μL质粒DNA，加入10 μL限制性核酸内切酶缓冲液，混匀。
- 加入1 μL限制性核酸内切酶，混匀。
- 37℃水浴反应3小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳- 配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA marker。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
质粒dna的酶切注意事项
质粒dna的酶切注意事项
在进行质粒DNA的酶切实验时，需要注意以下事项：
1. 选择合适的酶：根据质粒DNA上的目标片段的长度和序列选择适合的限制性内切酶。
确保酶的活性和适应温度等符合实验要求。
2. 控制酶切反应条件：酶切反应通常需要在特定的缓冲液中进行，确保缓冲液中的离子浓度、pH、温度等参数符合酶的要求，以保证酶的活性和稳定性。
3. 质粒DNA的纯度和浓度：使用纯度较高且浓度适当的质粒DNA进行酶切实验，以避免其他污染物的干扰或质粒DNA浓度过低的问题。
4. 酶切反应时间和温度：根据酶的特性和实验要求，控制酶切反应的时间和温度。
一般情况下，酶切反应需要在适宜的温度下进行一定时间，以保证完全的酶切反应。
5. 酶切后的处理：酶切反应结束后，需进行适当的处理。
如加入加热退火酶、磷酸酶等对酶活进行灭活；对反应产物进行凝胶电泳分析；采用柱层析、酚/氯仿提取等方法纯化目标片段等。
6. 实验操作的严谨性：酶切实验需要操作具有较高的严谨性和技巧性，避免因操作失误引入额外的误差。
在操作过程中，应保持实验环境的清洁，避免外源性
污染。
7. 安全措施：在进行酶切实验时，应遵守实验室的安全措施，包括佩戴实验手套、开启实验室排风设备等，以保障个人和实验室安全。
实验三、质粒DNA的酶切
操作步骤：
（一）酶切反应
1． 酶切混合液配制：将缓冲液5 μl、重组质粒DNA (5μg,30 ul)、 限制性内切酶5-10U（1ul）加至0.5ml Eppendorf管中，加双蒸水至 50 μl ，加盖，混匀后稍离心；
2. 37℃水浴箱中反应1-2h；
2.Subset酶：识别与切割序列相互有关的酶互称Subset酶，如SmaI的6 核苷酸序列中包含HpaⅡ的4核苷酸序列。Subset酶之间可以代替使用， 2个Subset酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子， 可以被其中一种酶识别，或均不能识别。
3.远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区 域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切 割，一般滑行10个碱基左右。在基因工程中有一定的应用价值。
3、酶切消化反应的温度，DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶 活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反 应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切 酶的最适反应温度高于或低于37℃。
4、DNA的分子结构，DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影 响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。有些 限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明 显差异，这种现象称内切酶的底物位点优势效应。
缓冲液
低离子强度 中离子强度 高离子强度
NaCl
TrisHCl(pH7.5) MgCl2
0～10 mmol／L 10 mmol／L 10 mmol／L
50 mmol／L 10 mmol／L 10 mmol／L
100 mmol／L 50 mmol／L 10 mmol／L
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告质粒DNA酶切实验报告引言：质粒DNA酶切是分子生物学实验中常用的一项技术，它通过利用特定的酶切酶将质粒DNA分割成特定的片段，从而方便进行进一步的实验操作。
本实验旨在通过质粒DNA酶切实验，探究酶切酶的作用机制以及其在分子生物学研究中的应用。
材料与方法：1. 实验所需材料：质粒DNA、酶切酶、缓冲液、酶切反应管、电泳装置等。
2. 实验步骤：a. 准备实验所需材料，并保持无菌环境。
b. 将质粒DNA与酶切酶、缓冲液混合，进行酶切反应。
c. 将反应产物进行电泳分离。
d. 观察电泳结果并进行分析。
结果与讨论：通过实验观察，我们可以得到以下结果和讨论。
1. 酶切反应结果：在酶切反应中，我们将质粒DNA与酶切酶一起进行反应。
根据酶切酶的特异性，我们可以得到特定的DNA片段。
通过电泳分离，我们可以观察到不同大小的DNA片段。
2. 酶切酶的作用机制：酶切酶是一种特殊的酶，它能够识别DNA序列上的特定碱基序列，并在该序列上切割DNA链。
这种特异性识别和切割的能力使得酶切酶在分子生物学研究中得到广泛应用。
常见的酶切酶有EcoRI、BamHI等。
3. 实验应用：质粒DNA酶切在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，通过酶切反应，我们可以将质粒DNA切割成特定的片段，从而方便进行进一步的实验操作，如克隆、测序等。
其次，酶切反应也可以用于检测DNA的特定序列，如PCR产物的验证等。
此外，酶切酶还可以用于DNA指纹图谱的构建、基因突变的研究等。
4. 实验注意事项：在进行质粒DNA酶切实验时，需要注意以下几点：a. 保持实验环境的无菌，避免外源性DNA的污染。
b. 选择适当的酶切酶和缓冲液，以确保酶切反应的有效性和特异性。
c. 控制酶切反应的时间和温度，避免过度切割或不完全切割。
结论：质粒DNA酶切是一项重要的分子生物学实验技术，通过酶切酶的作用，我们可以将质粒DNA切割成特定的片段，从而方便后续的实验操作。
酶切分析实验报告
一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定目的DNA片段。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Endonucleases）是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。
在基因工程中，限制性核酸内切酶用于切割DNA分子，以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。
本实验中，我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
根据酶切位点的不同，质粒DNA会被切割成不同长度的片段。
通过比较酶切前后的DNA片段，可以鉴定目的DNA片段。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取：根据试剂盒说明书提取质粒DNA。
2. 酶切反应：将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合，加入缓冲液，进行酶切反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 准备琼脂糖凝胶，加入电泳缓冲液。
- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。
- 连接电源，进行电泳。
- 电泳完成后，关闭电源，取出凝胶。
4. 凝胶成像与分析：- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。
- 根据标准DNA分子量标记，分析酶切产物的长度。
- 比较酶切前后的质粒DNA片段，鉴定目的DNA片段。
五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取：成功提取出质粒DNA，通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。
2. 酶切反应：限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA，产生不同长度的片段。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 电泳结果显示，酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。
- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物，可以确定酶切位点的位置。
基因工程实验2：质粒DNA的酶切及电泳鉴定
• 星号活力*
二、实验原理——琼脂糖凝胶电泳
• 1、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖加热溶解后冷却，形成孔径结构，成为良好的电泳 介质。其孔径大小由琼脂糖的浓度决定。
• 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强； • 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 kb~50 kb之间，常 用0.3%~2%浓度的琼脂糖凝胶，可分辨300 bp~5000 bp 的DNA片段。 • 低熔点（LMP）琼脂糖，熔点为62℃~65℃的琼脂衍生物， 一旦熔解，可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久， 在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖 可用来回收DNA分子，用于DNA片段的制备电泳。
四、实验步骤
• 1、质粒DNA的酶解（单酶切）
EcoR I 酶切位点：G’ AATTC
2、琼脂糖凝胶电泳
1、 0.8%琼脂糖凝胶的制备：称取0.16 g琼脂糖，置于锥形 瓶中，加入20 mL 0.5*TBE稀释液。（一个制胶板的量） 加热直至琼脂糖溶解。摇匀，冷却至60℃（不烫手），加 入溴化乙锭1μL （终浓度0.5 μg/mL）充分摇匀。 2、胶板的制备： 取有机玻璃内槽，洗净（注意保护电极丝）、晾干。 将有机玻璃内槽置于一水平位置，插好梳子。 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃 内槽上，注意排气泡，使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶 层。室温下静置，待凝固完全后，轻轻垂直拔出梳子。 用滴管将样品槽内注满TBE稀释液以防止干裂。制备好胶 板后将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中使用。 3、加样(见下表)
•（5）电泳缓冲液 •目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和 TPE •（6）EB
三、实验材料
• 1、仪器和材料 • 电泳仪，电泳槽，制胶板，锥形瓶(100 mL或 50 mL)，紫外检测仪/凝胶成像系统，一次性 手套，Ep管，取液器及无菌吸头，水浴锅 • 2、试剂 • (1) 质粒pMD18-T DNA • (2) DL2000 Plus • (3) EcoRI酶 (EcoRI酶解反应缓冲液10×) • (4) 琼脂糖 • (5) 溴乙锭(10 mg/mL贮藏液) • (6) TBE缓冲液(0.5×) • (7) 酶反应终止液(10×)
实验 质粒DNA的酶切
电泳
注意:务必记录点样顺序和点样量
接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正 负极) 恒压100V, 电泳40-60分钟 紫外灯下观察并记录结果 分析结果并鉴定样品纯度
大量酶切
无菌ddH2O
5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI
43 uL
16 uL 16 uL 5 uL 总体积 80 uL
Restriction enzyme name, recognition sequence
Hind III RI
A|AGCTT CTGCA | G TTCGA | A G | ACGTC
Bam HI Pst I
G|GATCC CCTAG|G G | AATTC
Eco
CTTAA | G
Sticky end or
cohesive end Eco RV
GAT | ATC
Blunt end
限制性内切酶
已经发现和鉴定了200多种 EcoRI 特 异 识 别 GAATTC及其互 补碱基组成的双 链片段 粘性末端 T4连接酶
酶单位定义：
酶反应条件：
缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的
分离范围/kb
5 - 60 1 - 20
0.7
0.9 1.2 1.5 2.0
0.8 - 10
0.5 - 7 0.4 - 6 0.2 - 3 0.1 - 2
纯度和浓度
加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶
影响限制性内切酶的因素： DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、 乙醇、EDTA、SDS) 解决办法： 增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂 增加酶作用单位 延长反应时间
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
AccⅠ识别序列
AccⅠ
能切割 T CCGG AGA
不能切割 T ×CCGG 6mATC
注意此处的区别
dam甲基化酶识别序列
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA 的甲基化。
③ 酶的星活性 (star activity)
又称第二活力，是指改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的 一种现象。由于识别特异性的降低，可能对原识别序列相似的序列也产生 切割反应。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆 位点——转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有 关的元件即成为表达载体。
Eco RV (10442)
35S prom oter UTR
多克隆位点 pUC18 MCS lacZ promoter
35S prom oter
Eco RV (8842)
绿色荧光蛋白基因 GFP NOS 终止子加尾信号
T-DNA right border
HPT 潮霉素抗性基因
加尾信号，终止位UT点R T-DNA left border
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
pBNA中由于有较多的EcoR Ⅴ识别位点，因此，经 EcoR Ⅴ酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一 的亮带。
酶切前的DNA
酶切后的DNA
实验材料和试剂
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
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加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶
影响限制性内切酶的因素： DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、 乙醇、EDTA、SDS) 解决办法： 增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂 增加酶作用单位 延长反应时间
酶的星号活性:
改变酶切条件时酶的识别位点专一性 下降的现象
部分酶切和完全酶切 酶的保存
思考题
对核酸进行限制性酶切时应注意什么？ 如何提高核酸电泳的分辨率？ EB染色的特点和注意事项是什么?
计算举例:
48502 /Marker DNA总量=同 等亮度条带的bp数/待测样品 的DNA量(ng)
不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性 DNA分子的有效范围
琼脂糖浓度/%
0.3 0.6
电泳
注意:务必记录点样顺序和点样量
接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正 负极) 恒压100V, 电泳40-60分钟 紫外灯下观察并记录结果 分析结果并鉴定样品纯度
大量酶切
无菌ddH2O
5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI
43 uL
16 uL 16 uL 5 uL 总体积 80 uL
影响泳动速率的因素
电场强度
DNA在电泳条件下带负电荷，在电场作用下向正极泳 动
分子量大小与DNA构型
质粒三种构型的泳动速率：超螺旋 线型 开环
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
凝胶浓度 电泳缓冲液： TAE TBE（大于实际分子量） TPE
分子量标准
定义: 在电泳测定DNA样
品的分子量及浓度的 过 程中所使用的标准样品对 照.
分离范围/kb
5 - 60 1 - 20
0.7
0.9 1.2 1.5 2.0
0.8 - 10
0.5 - 7 0.4 - 6 0.2 - 3 0.1 - 2
实验材料
50xTAE buffer
6xLoading buffer（溴酚蓝+蔗糖） 琼脂糖 溴化乙锭, goldviewna DNA marker（DNA HindIII/EcoRI）
质粒DNA
EcoRI及其BufferH
实验仪器
琼脂糖凝胶电泳系统 电泳仪，电泳槽，制胶板、梳子
Restriction enzyme name, recognition sequence
Hind III RI
A|AGCTT CTGCA | G TTCGA | A G | ACGTC
Bam HI Pst I
G|GATCC CCTAG|G G | AATTC
Eco
CTTAA | G
Sticky end or
台式离心机
紫外透射仪
实验步骤
一、制胶 将制胶槽及梳子放入制胶模具 称取0.2g琼脂糖于三角瓶中, 加入20mL1xTAE , 加热至无颗粒状琼脂糖 冷却至65C加入goldviewna(0.5ug/mL) 2.0uL 摇匀,倒入制胶槽中待凝固 拔取梳子放入电泳槽中备用 倒入适量(80mL) 1xTAE buffer
星活性
限制性内切酶识别特异性放宽。
EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但 如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松 动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别 能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位 点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子 强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚 枫，二价阳离子，12%乙醇。
实验 质粒DNA的酶切
小量酶切:
无菌ddH2O 5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI 总体积 13μL 4 μL 2 μL 1 μL 20 uL
混匀后,离心， 37°C酶切60分钟。
限制性内切酶
类型
I型 II型
III型
特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的特 殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在 此切割双链DNA。 多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸， 呈二元对称，少数识别更长的序列， 有的切割后形成平端，有的形成粘端。
cohesive end Eco RV
GAT | ATC
Blunt end
限制性内切酶
已经发现和鉴定了200多种 EcoRI 特 异 识 别 GAATTC及其互 补碱基组成的双 链片段 粘性末端 T4连接酶
酶单位定义：
酶反应条件：
缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的
样品准备
质粒
1uL质粒 + 1uL Loading buffer 混匀
酶切样品
10 uL DNA/EcoRI+2 uL Loading buffer
DNA marker
5uL DSTM 5000 (- HindIII/EcoRI)
加样
每2人一块胶 每人上2个样品（质粒原液、酶切样 品） 每块胶一个Marker（5μL）
实验四
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
背景知识介绍
DNA的电泳分离技术是基因工程中的一项
最基本技术。
特点：快速、简便、样品用量少、灵敏度 高以及一次测定中可获多种信息
琼脂糖凝胶电泳
DNA、 RNA检测和分离的重要手段。 其分离是根据分子大小与构型形成的分 子筛效应
适于分离200bp-50Kb的DNA片段
[实验原理]
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场 中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应 和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于 分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动 速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
常用类型:
-HindIII, HindIII/EcoRI, PCR marker
选用的原则:
构型与被测分子相同 标准片段分子能包含被测分子 某些分子量标准使用前需要进 行预处理
-HindIII
-HindIII/EcoRI
[目的要求] 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度
的原理；
了解电泳过程中各因素对测定结果的影响； 掌握制胶、电泳、浓度测定的基本分析技术 。