感受态及重组原理及步骤
制备感受态细胞的实验报告
制备感受态细胞的实验报告一、实验目的掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。
二、实验原理1.感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
（整理）感受态细胞的制备和重组质粒的转化
（整理）感受态细胞的制备和重组质粒的转化1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA 的细胞称为转化子。
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。
转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
【试剂与器材】〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
实验11、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
实验十一、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞【实验目的】掌握质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α，pUC18质粒【实验步骤】1、取制备好的存放于超低温冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放置于冰上静止5~10min 待其完全溶解。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DNA重组DNA重组（基因重组）是指，由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。
原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。
受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。
通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。
自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。
高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。
基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。
基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA 分子连接，得到重组DNA，并将其导入到受体中（微生物或高等动植物），从而使受体获得某些有益性状。
1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。
此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。
质粒把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
YAC、BAC、噬菌体、细菌质粒等是重组DNA技术中常用的载体。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
重组DNA的转化实验原理和操作步骤
重组DNA的转化实验原理和操作步骤实验目的制备出感受态细胞，把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
实验原理感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。
pUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。
实验操作（一）受体菌的培养与CaCl2 处理（无菌操作）1、取0.3ml种子液接到装有30 ml LB液体培养基的三用瓶中，振荡培养2-2.5小时2、取出一定量菌液置于冰浴10分钟3、4，000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体4、把菌体悬浮在4 ml 100mM冷CaCl2 中，冰浴25分钟。
5、5，000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体6、再把菌体悬浮在1ml 100 mM冷CaCl2 中置4 ℃ 12-24小时，备用。
（二）倒皿铺平板1、按照各组转化反应的混合物控制不同的选择性培养基（20 ml/皿）LB固体培养基（100 ml）Amp（60μg/ml）Tet（40μg/ml）供连接混合物转化，pUC18转化用，共5皿LB固体培养基（100 ml）Amp （60μg/ml）X-gal （40μg/ml）IPTG （24μg/ml），供连接混合物转化，pUC18转化用，共5皿2、转化反应前一天，先铺好平板3、取各组反应物在平板上涂布4、培养皿倒置于37℃培养箱中过夜5、观察转化子出现的情况（三）转化反应待转化DNA的准备我们需将连接混合物，提取的pUC18两种样品作转化反应，按下表准备取上述两组混合物在Eppendorf管中，按如下处理：1、将各组Eppendorf管置冰浴/小时以上2、把上述样品置42℃水浴中，2分钟3、转移到37℃水浴中5分钟，加800μl LB液体培养基4、在37℃摇床上振荡培养1小时，取25μl涂皿。
感受态制备、转化
实验目的
1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的 原理
2、熟悉实验的操作具体步骤，掌握无菌 操作技术
3、掌握抗生素、蓝白斑筛选重组质粒转 化成功的克隆菌
一、感受态细胞的制备
感受态：指受体最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是 由受体菌的遗传性状决定的，同时也受菌龄，外界环境因子影响。处于感 受态的细胞称作感受态细胞。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜 幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。 正常状态下，细菌会分泌一种酶将外源DNA降解，只有某一生长阶段中 的细菌才能做为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。 感受态形成后，细胞的生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责 供体DNA的结合和加工等。细胞通透性增加，能接受外来的DNA分子进 入细
2、将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s （不要摇动Ep管），然后将Ep管迅速转移到冰浴，冷却 2min
3、立即向上述管中加入400µl 的LB液体培养夜，然后37℃振 荡培养约45min 。（此时间段可以去吃饭）
4、取100µl转化细胞转移到含有抗生素的LB固体平板上，用 灭菌的玻璃棒涂布均匀，（玻璃棒酒精灯烧过后稍微凉 一下再用，不要过烫），室温放置几分钟待菌液完全被 培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养 过夜。
DNA序列。 两者可以通过互补的机制形成有功能活性的β-
半乳糖苷酶分子，此为α互补法。
β-半乳糖苷酶分解显色底物X-gal显蓝色。
当外源片段插入， lacZ基因不能表达，菌株呈
白色。
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 IPTG
培养皿内菌落生长状况及结果分析
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
思考题
影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 如何利用抗性筛选出重组克隆？
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biology
演讲者：
分：分离外源基因目的基因。
单击此处添加小标题
转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。
单击此处添加小标题
切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。
单击此处添加小标题
筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。
实验原理
C
B
A
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器、材料
．超净工作台 ．高速离心机 ．恒温摇床 ．恒温培养箱 ．恒温水浴锅 ．制冰机 ．移液枪
实验材料、试剂
大肠杆菌JM109菌株 重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 试管、培养皿
LB液体培养基 含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µg／mL） 氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液
受体菌的培养
单击此处添加小标题
质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化
单击此处添加小标题
感受态细胞的制备
单击此处添加小标题
实验 安排
单击此处添加小标题
实 验 安 排
一、受体菌的培养
从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做） 将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。
细胞基因重组实验报告
一、实验目的1. 掌握基因重组的基本原理和操作步骤。
2. 学习制备感受态细胞的方法。
3. 掌握重组DNA的转化和筛选技术。
4. 观察和记录实验结果，分析实验数据。
二、实验原理基因重组是指将不同来源的DNA片段在体外连接成新的DNA分子，从而改变生物体的遗传特性。
本实验通过制备感受态细胞，将重组DNA导入细胞内，筛选出含有目的基因的细胞。
三、实验材料与试剂1. 材料：大肠杆菌菌株、质粒、DNA连接酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 试剂：LB培养基、氨苄西林、琼脂糖、DNA标记染料、电转化仪、PCR仪、凝胶成像仪等。
四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，37℃培养过夜。
（2）取过夜培养物，按照1:100的比例加入新鲜的LB培养基，37℃培养至OD600值为0.5～0.6。
（3）将培养物在冰上放置30分钟，然后置于42℃水浴中5分钟。
（4）迅速将培养物转移到冰上，加入适量氨苄西林，混匀。
2. 重组DNA的构建（1）将质粒和目的基因分别用限制性核酸内切酶进行酶切。
（2）将酶切后的质粒和目的基因在DNA连接酶的作用下连接成重组DNA。
（3）将连接产物进行PCR扩增，验证重组DNA的正确性。
3. 重组DNA的转化（1）将制备好的感受态细胞均匀涂布在含有氨苄西林的LB琼脂糖平板上。
（2）将PCR扩增的重组DNA加入感受态细胞中，混匀。
（3）将混合物在冰上放置30分钟，然后置于42℃水浴中5分钟。
（4）将混合物转移到37℃培养箱中培养过夜。
4. 重组细胞的筛选（1）将培养后的平板在37℃培养箱中培养过夜。
（2）挑取单克隆菌落，进行PCR扩增，验证目的基因的表达。
五、实验结果与分析1. 感受态细胞的制备实验过程中，制备的感受态细胞在平板上生长良好，表明制备成功。
2. 重组DNA的构建通过PCR扩增，成功得到预期大小的重组DNA片段，表明重组DNA构建成功。
3. 重组细胞的筛选在平板上观察到氨苄西林抗性菌落，挑取单克隆菌落进行PCR扩增，验证目的基因的表达。
研究生实验五 大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选
1 目的基因的获取
1.1 化学合成法：已知序列 1.2 基因组DNA： 将某种生物的基因组DNA切割成一
定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行 克隆。这些存在于所有重组等 反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用
(2)免疫学方法：
如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白 质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。
抗 药直 性接 标选 记择 选法 择
( )
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
α 互 补 的 检 测
未转化的菌不具有抗 性，不生长； 转化了空载体，即未 重组质粒的菌，长成 蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌， 即目的重组菌，长成 白色菌落。
3 实 验 步 骤
弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净
制备受态细菌
沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 110 μ l，重悬菌体。 取感受态细菌100 l转移到一无菌的1.5 ml的EP管中 每管加入质粒5 l 轻轻旋转EP管，混匀混合物，在冰浴上放置20min 试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动EP管 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min 取出EP管，每管加入LB培养基400 l 置于370C摇床（100~150 rpm），温和震荡30min
3 外源基因与载体的连接
①粘性末端连接： GGATCC CCTAGG
感受态细胞的制备、转化及重组质粒的筛选
蓝白斑筛选则能在转化子的基础上区分空载体和连
接成功的载体（连接上SOD基因的pUC18载体）。
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
载体
多克隆位点 LacZ’基因
β-半乳糖苷酶启动子
3. 取菌液1.5ml于EP管中，冰上放置5-10 min；4℃， 4000 rpm离心4 min，去上清，收集菌体。（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴5-10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质粒 DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上2530min。
激活 IPTG
非代谢性的乳糖启动子诱导剂
含有X-gal和IPTG的培养基
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏
载体
无法生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
含有X-gal和IPTG的培养基
操作步骤
1. 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞，冰浴10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入 50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质 粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上 25-30min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase （DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/ 质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109--1010转化子/闭环DNA。
因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株，OD600为 0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。
一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10--100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
⑶、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑷、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
1、大肠杆菌感受态细胞的制备： 1）从新活化的E. coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。
将该菌悬液1：100～1：50接种于100ml LB 液体培养基中，37℃震荡扩大培养，至OD600约0.5～0.7； 2）培养液在冰上冷却10分钟，转入离心管中，于0～4℃，4000rpm离心1分钟； 3）倒净上清，用20ml冰冷的0.1mol/L 氯化钙溶液，轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟； 4）0-4℃，4000rpm 离心10分钟，弃上清，加入5ml冰冷的0.1mol/L 氯化钙溶液，轻轻悬浮细胞,冰上放置片刻，即制成了感受态细胞； 5）将感受态细胞分装为200ul/Ep管，冰上放置，48小时内均可用于转化。
如暂时不用，可加入占总体积20-25%左右已灭菌的甘油，混匀，-70℃条件下可保存一年。
2、重组子转化受体细胞： 1）两管感受态细胞，分别加入正对照质粒（约50ng 体积不超过2ul）以及上次实验的所有连接产物； 2）轻轻混匀，冰上放置30分钟后，于42℃
水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3-5分钟； 3）在上述各管中加入800ul LB液体培养基，混匀，37℃，100rpm，培养45-60分钟复苏，使已转化的细胞繁殖1-2代，并表达抗性蛋白；4）取两块LB平板，于平板表面加入40ul X-gal 和4ul IPTG，并用无菌三角推棒涂布均匀，于超净工作台上吹干多余液体； 5）低速离心，使细胞沉于管底，吸去800ul上清，然后将剩余液体加入到含相应抗生素的LB平板，用无菌三角推棒涂布均匀，于超净工作台上吹干多余液体。
将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12-16小时，至菌落生长良好； 6）于4℃将平板放置1小时，使菌斑兰色充分显现。