CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化
大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化准备工作：1、LB琼脂平板若干。
2、50mL离心管若干，加满超纯水后于121℃20分钟灭菌备用。
3、含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶若干，121℃20分钟灭菌烘干。
4、1.5mL离心管若干，121℃20分钟灭菌烘干。
5、22﹪灭菌甘油溶液：22mL甘油加入78mL超纯水，121℃20分钟灭菌，保存于4℃。
试剂：1、100mL1mol/LCaCl2溶液：14.7gCaCl2.2H2O用超纯水配制成100mL贮存液，灭菌备用，保存于4℃冰箱。
2、100mL0.1mol/LCaCl2溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL灭菌超纯水混匀，保存于4℃冰箱。
3、100mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL22﹪的灭菌甘油溶液，混匀，保存于4℃冰箱。
感受态细胞制备：1、晚上从－70℃冰箱活化大肠杆菌（如DH5α或JM109），划LB平板，37℃培养过夜。
2、晚上从培养平板上挑取单菌落接种到一支3mLLB液体培养基试管，37℃培养过夜。
3、早上按1：100比例将过夜培养菌液接种到含有50mLLB液体培养基的250mL 三角瓶中，200rpm，37℃培养1-2hr左右，测OD600到0.2-0.3时，转到50mL离心管，冰浴10分钟左右。
4、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。
5、去上清，用0.1mol/L10mLCaCl2溶液重悬菌体，水浴20分钟左右。
6、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。
7、去上清，将收集的菌体用1mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液重悬，分装成100μl每个离心管，与－70℃保存。
8、必要时以浓度已知的标准质粒转化制备的感受态细胞以估计效率。
转化：1、从－70℃冰箱取出含有感受态细胞的离心管，在超净台上冰浴，待其融化后，加入连接产物或对照质粒，冰浴30分钟。
2、将离心管从冰浴取出并迅速转到42℃水浴热激90s，然后转冰浴2分钟。
CaCl2法制备感受态细胞
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
感受态细胞的制备及转化
实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
感受态细胞的制备的实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞
实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。
实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。
菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。
目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1. 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
大肠杆菌感受态细胞制备
E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。
二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。
注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。
三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。
此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。
四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。
转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。
在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。
注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。
培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。
五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。
2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。
3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
1.CaCl2法制备感受态细胞(分子克隆)
2007-4-19 健康科学研究所 B细胞与自身抗体研究组 刘占杰CaCl2法制备感受态细胞1、划线（无选择性LB-Agar平板），37℃培养16-20h；2、挑单菌落到2ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜；；3、取1ml过夜菌液到100ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3hr，检测OD600nm about 0.44、将菌液转移到50ml BD管中，冰上放置10min；5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置1min；6、用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2,20mmol/l CaCl2）溶液30ml重悬细胞沉淀,冰上30min；7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置1min；8、用2ml预冷0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μl／管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃。
附：0.1mol/l CaCl2： 100ml(1.1g 无水CaCl2＋100mlddH2O)高压除菌；0.1mol/l CaCl2-MgCl2: 150ml(2.439g MgCl2·6H2O, 0.333g 无水CaCl2＋150mlddH2O) 高压除菌；转 化1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入1μl（50ng）待转化质粒；2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min3、加入SOC或LB培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；4、取200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养14-18h，观察菌落；质粒小抽(Beyotime)1、挑单菌落到3ml 选择性LB培养液中，37℃，225rpm，14-18h；2、收菌液到1.5ml EP管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一次，每管收集3ml菌液）3、用250ul溶液I预冷（保证P1已加RNase），Vortex重悬细胞；4、加溶液II 250ul，颠倒混匀4-6次，室温3min；5、加入350ul溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生;6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心60秒，倒弃收集管内液体；在质粒纯化柱内加入750ul溶液IV，最高速离心60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;8、将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50ul溶液V至管内柱面上(中央)，放置1min; 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。
CaCl2法制备感受态细胞
E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）一、准备工作1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。
甘油灭菌。
10ml移液管3支。
高温灭菌1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
2．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
3．配置1M KOH 和0.2 M醋酸以调节pH用。
4．制备针式过滤器2个，50ml、20ml 一次性注射器各一个。
5．冷冻离心机换50ml转子。
6．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照下表配制TFB1和TFB2工作液，化学药品现称量，再调pH值，过滤除菌，放在冰上或冷后4℃储存。
当天现配现用。
100 ml菌液用30 ml TFB1工作液和4 ml TFB2工作液，按此比例类推。
二、操作步骤：全过程冰上操作，4℃离心，无菌操作。
第一天：划板。
挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
第二天：1、从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
第三天：2、按1：100将1ml培养物接种到100毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、0℃（冰上）预冷15分钟。
4、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置90分钟。
准备高温灭菌过的1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
(先用3ml的F1振荡悬浮再加入剩下的12ml)5、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用2ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置15分钟。
6、按50ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，扔入液氮速冻再拿出来转入-80℃冰箱储存。
实验10、大肠杆菌感受态的制备
实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠，无水CaCl2，蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒【实验步骤】1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。
CaCl2法制备感受态细胞
E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）一、准备工作1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。
甘油灭菌。
10ml移液管3支。
高温灭菌1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
2．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
3．配置1M KOH 和0.2 M醋酸以调节pH用。
4．制备针式过滤器2个，50ml、20ml 一次性注射器各一个。
5．冷冻离心机换50ml转子。
6．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照下表配制TFB1和TFB2工作液，化学药品现称量，再调pH值，过滤除菌，放在冰上或冷后4℃储存。
当天现配现用。
100 ml菌液用30 ml TFB1工作液和4 ml TFB2工作液，按此比例类推。
二、操作步骤：全过程冰上操作，4℃离心，无菌操作。
第一天：划板。
挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
第二天：1、从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
第三天：2、按1：100将1ml培养物接种到100毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、0℃（冰上）预冷15分钟。
4、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置90分钟。
准备高温灭菌过的1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
(先用3ml的F1振荡悬浮再加入剩下的12ml)5、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用2ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置15分钟。
6、按50ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，扔入液氮速冻再拿出来转入-80℃冰箱储存。
20CaCl2法感受态制备
CaCl2法感受态制备
实验准备：灭菌0.1M CaCl2溶液(0.05mol/L CaCl2也可以)、含40%灭菌甘油，灭菌50mL离心管
实验步骤（以下提到的LB培养基均含有对应抗生素）
1.菌种的活化：以感受态细胞在LB的平板上进行划线分离。
2.菌种的前培养：从LB平板上挑取单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，37℃振荡
培养过夜至对数生长中后期。
3.菌种的准备：将该菌悬液以1:100的比例分别接种于100mlLB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。
5.感受态细胞的制备：
①把上述的锥形瓶放到冰水浴20min使其冷却。
把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
②弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
③弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用移液枪轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
④弃去上清液，加入1.5mL 0.1M CaCl2溶液，1.5mL 40%甘油，用移液枪轻轻吹打
使沉淀混匀，并分装到灭菌1.5mL离心管，放置在冰盒上。
⑤准备好液氮盒子，在冰盒上摆放好0.5ml离心管，将感受态细胞悬液分装成100µl
或200µl每管。
⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。
化学转化感受态制备
化学转化感受态制备化学转化感受态制备是分子生物学中常用的一种技术，通过此方法可以有效地将外源DNA引入到细胞内。
本文将详细介绍化学转化感受态制备的过程及相关注意事项。
一、化学转化感受态制备原理化学转化感受态制备是利用化学物质（如CaCl2）处理细胞，使其处于一种能高效吸收外源DNA的状态。
在这个过程中，细胞膜会发生改变，使得DNA能够更容易地通过细胞膜进入细胞内。
二、化学转化感受态制备步骤1.细胞培养：选取合适的宿主细胞，进行传代培养，使细胞处于对数生长期。
2.收集细胞：将对数生长期的细胞用离心机收集，弃去培养液。
3.洗涤细胞：用预冷的PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞2-3次，以去除残留的培养液。
4.重悬细胞：用适量的CaCl2溶液重悬洗涤后的细胞。
5.加入DNA：将待转化的DNA加入细胞悬液中，轻轻混匀。
6.化学转化：将细胞-DNA混合液置于冰浴中30分钟，使细胞充分吸收DNA。
7.恢复细胞生长：将化学转化后的细胞用预冷的PBS洗涤2次，然后加入新鲜培养液，恢复细胞生长。
三、注意事项1.选择合适的宿主细胞：不同的宿主细胞对化学转化的敏感性不同，需根据实验需求选择合适的宿主细胞。
2.细胞状态：进行化学转化时，细胞应处于对数生长期，此时细胞活力强，转化效率高。
3.DNA质量：使用高质量的DNA进行化学转化，可以提高转化效率。
4.温度控制：化学转化过程中，温度应严格控制在0-4℃，避免细胞受损。
5.转化后培养：化学转化后，需用新鲜培养液恢复细胞生长，以提高转化效率。
四、总结化学转化感受态制备是一种简单、高效的分子生物学技术，通过掌握该技术，研究者可以成功地将外源DNA引入到宿主细胞中，为后续实验奠定基础。
（注：本文仅作为学术交流，禁止用于商业用途。
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞(1)
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞(1)实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。
实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。
菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-19 6)℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
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CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
⏹1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液
体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；
⏹ 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振
荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；
⏹ 3、培养物于冰上放置20min；
⏹ 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的
0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；
⏹5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的
0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；
⏹ 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的
0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感
受态细胞悬液；
⏹ 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置
12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右
高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，
可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中
37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振
荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上
操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
打匀，使细胞重新悬浮；
9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超
低温冷冻贮存备用（－70℃）。
注意事项
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使
用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；
2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的
推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的
活菌数随时间延长而减少造成的）；
4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子
（如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
5 ．所使用的器皿必须干净。
迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能
大大降低细菌的转化效率；
6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；。