血清总蛋白测定(双缩脲试剂法)

生物化学实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）

实验日期2014-11-21实验地点第五实验室

合作者指导老师

评分教师签名批改日期

一、实验目的

1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；

2、熟悉血清总蛋白的临床意义；

3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、实验原理

（一）：双缩脲反应

在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。

三、材料与方法：

实验材料

样品：大牛血清

试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（%）

器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球

设备：1100分光光度计、水浴锅

实验步骤

取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：加入物（ml） B (空白）S （标准）U（待测）

大牛血清（1：10）--

蛋白标准液（1：10）--%氯化钠溶液--

双缩脲试剂

a.各管混匀，观察各试管颜色

b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色

c.将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度。

d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管

依据公式算出结果

四、结果与讨论：

（一）：实验结果

1、实验现象：

a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；

b、水浴20分钟之后，B试管试管显淡蓝色；S试管和U试管显浅紫色且S试管的颜色比U试管的颜色稍深。

2、实验数据：

管号测定次数平均吸光度

1 2 3

S

U

3、结果计算：

将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L),得出结果：血清总蛋白=L

（二）：结果讨论

查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下：

1、成功的方面：

a.在本次试验出现了预期的结果：S和U试管溶液显淡紫色，B试管显淡蓝色。S和U 试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅，B试管显浅蓝色的原因是B试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。

b.水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。

2、误差分析：

a.所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低

b.待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏低

c.操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大

五：结论

样品的蛋白质含量偏低

复习思考题

1.什么叫双缩脲试剂为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾

双缩脲试剂

2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入

3.简述血清总蛋白测定的临床意义。