双缩脲法测定蛋白质含量

实验三双缩脲法测定蛋白质含量

目的

1．掌握双缩脲法测定蛋白质的具体操作和原理；

2．了解蛋白质测定在生命科学中的应用。

原理

双缩脲反应是指双缩脲在硷性溶液中能与Cu2+络合生成紫红色物质。双缩脲可由脲缩合而成。

蛋白质分子的肽链结构在硷性中也能与Cu2+络合生成紫红色络合物，因其反应机制相似，就把蛋白质的这一反应称为蛋白质的双缩脲反应。

由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分于肽链氨基酸残基的侧链功能基关系较小。因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。利用双缩脲反应生成的有色物质作蛋白质的比色测定受蛋白质种类的影响较小。这是本法的优点之一。此外试剂和操作的简单也是其优点。缺点是灵敏度较低，能测出的蛋白质浓度约须在0.5mg／ml。

本实验用双缩脲法测定血清的总蛋白质浓度。如结合盐析法(饱和硫酸钠)分离白蛋白和

球蛋白还可用于血清白蛋白和球蛋白浓度及其比值(A／G)的测定。

器材

1．试管及试智架

2．0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)

3．1ml、2ml、5ml刻度吸管

4．721型分光光度计

试剂

1．0.9％NaCl

2．双缩脲试剂称取CuSO45H2O结晶(AR级试剂)1.5g,酒石酸钾钠(AR级试剂)6.0g溶于500ml水中，添加10％NaOH 300ml及KI1.0g．混匀后加水稀释至1000ml。本试剂可长期保存。

3．牛血清白蛋白标准液此溶液可用于替代标准血清。称取试剂级冻干牛血清白蛋白300mg置lOOml容量瓶中，用0.9％NaCl溶解后稀释至刻度，避免振摇起泡，置4℃冰箱保存。此标准液浓度为300mg／m1。

4．被检血清样本

操怍

1. 取试管1支，以0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)吸取被检血清0.200ml(吸管外壁须用滤纸片拭净)。慢慢放入试管底部。最后一点液体应吹出，靠落在试管壁上。

2．加入0.9%NaCl 3.80ml,充分混匀但不要振摇起泡。

3．另取试管二支，标上号码，其一用吸管加入操作2所准备的血清样本稀释液1.00ml 另一管加入牛血清白蛋白标准液1.00ml。二管各加入双缩脲试剂4.00m1，混匀，放置半小时后以1m1蒸馏水加4m1双缩脲试剂作空白调节比色计零点，选用蓝色滤光片或500nm波长光作比色。

4．计算

思考题

1.为什么稀释血清样本时应避免振摇起泡?

2.是否可用硫酸铵盐析分离白蛋白和球蛋白结合用双缩脲法分别测定这两个血清蛋白质的组份试讨论之。