双缩脲法蛋白质含量测定

实验17 蛋白质含量测定（双缩脲法）

一、目的

掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。掌握分光光度计的使用方法。

二、原理

碱性溶液中双缩脲（NH 2 一co 一NH 一co 一NH 2 ）能与Cu 2 + 产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。其可测定范围为1- l0mg 蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。Tris ，一些氨基酸，EDTA 等会干扰该测定。

三、仪器、试剂和材料

1 ．仪器

（1) 分光光度计（2 ）分析天平（3 ）振荡机（4 ）刻度吸管：1m1X2 ，5m1X2 ，10m1 X 1 (5 ）具塞三角瓶：1OOml （6 ）漏斗：13 个

2 ．试剂

（ 1 ）双缩脲试剂：取硫酸铜（Cu S0 4 5H 2 O ）1.5g 和酒石酸钾钠（NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ）6.0g ，溶于500m1 蒸馏水中，在搅拌的同时加入300m1 10% NaOH 溶液，定容至1000 ml ，贮于涂石蜡的试剂瓶中。（ 2 ）0.05mol/L 的NaOH 。

(3) 标准酪蛋自溶液：准确称取酪蛋白0.5g 溶于0.05mol/ L 的NaOH 溶液中，并定容至100m1, 即为5mg/m1 的标准溶液。

3 ．材料

小麦、玉米或其他谷物样品，风干、磨碎并通过100 目铜筛。

四、操作步骤

1 ．标准曲线的绘制

取 6 支试管，编号，按下表加入试剂：

震荡15min ，室温静置30min ，54Onm 比色，以蛋白质含量（mg ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2 ．样品测定

（ 1 ）将磨碎过筛的谷物样品在80 ℃下烘至恒重，取出置于燥器中冷却待用。

（ 2 ）称取烘干样品约0.2g 两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分别加入5ml 0.O5mol ／L 的NaOH 溶液湿润，之后再加入20ml 的双缩脲试剂，震荡15min ，室温静置反应30min ，分别过滤，取滤液在540nm 波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量（mg ）。

从标准曲线上查得的蛋白质含量(mg )

五、结果处理

六、注意事项

1 ．三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。

2 ．所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。

七、思考题

双缩脲法测定蛋自质含量的原理是什么？