细胞培养标准流程

细胞间基本规定

每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。

显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。

超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。

带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。

细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称

细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。

细胞培养标准流程

1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）

Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。

步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌

2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基

3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次

4.消化：加入1ml%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO

放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。

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5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。

6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培）

（细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）

7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染

TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）

细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。

以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。

取 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。

(转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min）

无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10％。如6孔板加4mL培养液培养，即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。

缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。

转染后6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。

24～48 h 后收集细胞用于后续实验。

Note：如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞，这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。

HiPerFect转染试剂转染（用于siRNA的转染，说明书附后）

For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA 以6 孔板为例，转染之前，以2mL全培接种×105细胞于6孔板每孔。

将细胞放置在培养箱中培养，直至转染。（前50%---染90%）

取 ml 离心管，加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入

siRNA(20uM浓度，相当于μL)5uL,转染试剂12μL，轻轻混匀，室温

静置5-10 min。

siRNA：转染试剂：无血清无双抗DMEM 5uL：12ul：100ul。（比例待定）

将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。

24～48 h 后收集细胞用于后续实验。

3、细胞冻存（慢冻快融）

1）配冻存液：全培＋10%DMSO或者90%胎牛＋10％DMSO。（保护细胞膜不被冻坏）2）提前准备好程序性降温盒。

3）标记冻存管：帽子：细胞系名称冻存者

侧面：细胞系名称冻存者冻存

时间

级别（按照细胞状态标记A＋，A，B）,太差的别冻

4) 细胞经过换液消化后，离心，弃上清.加入2ml的预先配好的冻存液，

快速吹打混匀。若不离心，则在冻存管中加100μL DMSO+900μL细胞悬液。

5) 冻存顺序：用冻存仪（程序性降温盒）－80℃过夜→液氮。

或者4℃半小时→－20℃2小时→－80℃存储。

冻存仪的使用方法

1、确认冻存仪内的异丙醇是否已经使用5次，准备细胞，放入冻存盒（最

多18管）。

2、将冻存盒放入-80℃冰箱，并登记信息（冻存者，冻存细胞名称，异

丙醇使用次数）

3、至少三个小时后（过夜），将细胞取出放置于自己的细胞盒内或液氮中。

4、将冻存盒取出放回原处。

冻存盒内需放置250ml的异丙醇，异丙醇使用4-5次后需要更新

4、细胞复苏（DMEM培养液+10%FBS+1%双抗）

1)准备37℃水浴箱，10mL离心管，配制相应培养基，标记好培养皿。

（离心管和培养皿可提前加好约5ml培养基）

2) 将取出的细胞冻存管快速投入到温水中，同时手握冻存管快速搅动，

让细胞以最快的速度融解。

3）吸取所有融化的细胞悬液至加有5倍体积培养基的离心管中。

4）离心800rpm，3min。

5）弃上清，加全培重悬细胞。

6）依次加2ml细胞悬液和10ml全培入新培养皿。

（6cm小圆盘上加入 2 ml的全培;10cm大圆盘上加入10ml的全培）。

7）混匀(十字混匀)，CO

培养。

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标准程序：

3）离心1000rpm，2-3 分钟；弃上清，加入1ml全培重悬后转入10ml 管，再加入4-5ml全培重悬

4）离心1000rpm，2-3 分钟，离心期间，在6cm小圆盘上加入 2 ml的全培 10cm大圆盘上加入10ml的全培5）弃上清，加入1ml全培重悬随后加入到上述的6cm小圆盘中

Note：细胞请在6cm的小圆盘内

细胞离心后请用全培再洗一遍尽量去除DMSO的影响