IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节基因I o I基因编码一种阻遏蛋白，后者与0序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP ）结合位点。
由P序列、0序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达°在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在PI 启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与0序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与0序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG ）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
材料1、诱导表达材料（1 ） LB （Luria —Bertani ））培养基酵母膏（Yeast extract） 5g 蛋白胨（Peptone） 10gNaCl 10g 琼脂（Agar） 1-2%蒸馏水（Distilled water） 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌（2 ） IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL蒸馏水中，0.22 滤膜过滤除菌，分装成 1 mL /份，—20保存。
（3 ） l 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI （ pH 6.8 ）50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 %溴酚蓝10 %甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1 ）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI （ pH 8.0 ）1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达得原理IPTG诱导得产物就是重组后表达载体中得插入序列所能够翻译得责白，并可视载体构建情况翻译后续得标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达得时候，需要诱导物进行诱导（相当于点火），但乳糖可以被细胞利用掉，所以利用IPTG （异丙基一B—D-硫代半乳糖苗）在结构上与乳糖得相似性也可以将基因表达启动，但它不能被细胞利用掉，从而实现持续得表达、IPTG就是一种诱导外源基因表达得诱导剂，它不仅仅如我们学过得作为乳糖得类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖甘酶，它就是一种普遍应用得诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但就是它能诱导基因表达得具体原理我却了解得不就是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴.最早应用于得表达系统就是Lac乳糖操纵子,乳糖得类似物IPTG 可以与怡。
I产物结合，使其构象改变离开la cO,从而激活转录、山这种可诱导得转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建得常用元件。
t ac启动子就是t rp启动子与1 a cUV5得拼接杂合启动子, 且转录水平更高，比1 acUV5更优越。
trc启动子就是t rp启动子与1 ac启动子得拼合启动子，同样具有比trp更高得转录效率与受1 ad阻遏蛋白调控得强启动子特性.在常规得大肠杆菌中，lacl阻遏蛋口表达量不高，仅能满足细胞自身得lac操纵子，无法应付多拷贝得质粒得需求，导致非诱导条件下较高得本底表达,为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lac I阻遏蛋白得laclq突变菌株常被选为Lac/Tac/t r c表达系统得表达菌株。
现在得La c /Tac / trc 载体上通常还带有1 aclq基因，以表达更多lacl阻遏蛋白实现严谨得诱导调控。
I PTG广泛用于诱导表达系统,但就是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目得得重组蛋口并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物得研究。
另外一种研究方向就是用lacl得温度敏感突变体，30度下抑制转录,42度开发。
IPTG诱导蛋白表达全面介绍
IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。
然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
IPTG诱导表达蛋白步骤
IPTG诱导表达蛋白步骤15-11-3配固体培养基和液体培养基，灭菌。
配BindingBuffer和脱盐液各500ml。
在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。
溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。
倒板：（5个灭菌的培养皿）①微波加热溶解固体培养基（每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。
②超净台操作，以1˸1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。
③倒板。
④培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱中15-11-4热转化：（将质粒导入大肠杆菌中）①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。
②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。
③摇床上摇45min，150rp，37℃。
（使菌体复苏）④离心，3000rpm3min。
⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。
（12~16h）15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。
挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）①提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。
（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。
②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。
将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清）③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。
（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。
15-11-6扩大培养、诱导表达①以（抗生素˸培养基）1˸1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导的外源蛋白表达专题培训课件
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
2.1 乳结合位
点（ribosome binding site，RBS）特征的 Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元 开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA 上。
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
操纵子（o）序列位于启动子（p）与被 调控的基因之间，部分序列与启动子序列 重叠。
在乳糖操纵元中，调控基因lac I位于Plac 邻近，有其自身的启动子和终止子，转录 方向和结构基因群的转录方向一致，编码 产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。
了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止 了基因的转录起动，从而阻遏了这群基 因的表达。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷 酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R 的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与 操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻 遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利 用乳糖的酶类，β－半乳糖苷酶在细胞内的含 量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的 诱导作用。
这些基因头尾相接，上一个基因的翻译终止 码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一 个核糖体能沿此转录生成的多顺反子mRNA 移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白 质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA 移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依 次合成这基因群所编码所有的蛋白质。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
IPTG诱导蛋白表达的原理
I P T G诱导蛋白表达的原理IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】I P T G诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
《IPTG诱导的原理》课件
IPTG和lac操作子
IPTG结构
IPTG的结构和lac操作子的相互作用关系是实现诱导 的关键。
lac操作子
lac操作子是一段DNA序列，在细菌中起到调控转录 的作用。
IPTG的工作机制
1 结合lac重pressor
IPTG与lac重pressor结合，改变其构象，释放lac操作子。
2 激活转录
IPTG诱导的原理
1
基于lac操作子
lac操作子是一段DNA序列，包含启动子
去除lac重pressor
2
和操作子，通过结合lac重pressor蛋白控 制了lac基因的转录。
IPTG结合到lac重pressor上，使其释放lac
操作子，允许RNA聚合酶结合，并开始转
录目标基因。
3
蛋白质表达
转录的mRNA被翻译成蛋白质，最终实现 目标基因的表达。
lac操作子中的启动子可供RNA聚合酶结合，启动基因转录。
3 蛋白质合成
转录产生的mRNA翻译成蛋白质，实现目标基因的表达。
IPTG的应用领域
基因表达研究
IPTG用于激活目标基因的表达， 广泛应用于基因调控研究中。
蛋白质纯化
通过诱导表达目标蛋白质，使 用IPTG可以提高蛋白质纯化的 效率。
药物筛选
IPTG可用于激活药物敏感基因 的表达，进行药物筛选和研发。
IPTG诱导的优缺点
优点
IPTG具有高特异性和可调节性，能够精确控制基因表达。
缺点
使用IPTG需要额外成本，且不适用于所有生物体系。
总结和展望
IPTG是一种在分子生物学研究中广泛应用的诱导剂，通过结合lac操作子实现目标基因的表达。随着技术的发展， 对IPTG的研究将更加深入，为基因工程和生物医学研究提供更多的可能性和应用。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是 trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI 阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的 lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
IPTG诱导蛋白表达
IPTG诱导蛋白表达E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（C AP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
IPTG诱导蛋白表达的原理
.诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，IPTG 并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
需要诱导物进行诱,用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候-D-异丙基-β相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG((导但它基因表达启动,硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将.,从而实现持续的表达不能被细胞利用掉是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作IPTG它是一种普遍应用的为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
我在网上查但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，到以下一些内容，供查阅者借鉴。
可IPTGLac乳糖操纵子，乳糖的类似物最早应用于的表达系统是. ，从而激活转录lacI产物结合，使其构象改变离开lacO以和达系统载体构建的常这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表的拼接杂合启动子，且转trp启动子和lacUV5用元件。
tac启动子是启动lac子是启动trp启动子和更优越。
录水平更高，比lacUV5trc 阻遏蛋白更高的转录效率和受同样具有比trplacI 子的拼合启动子，阻遏蛋白表达量lacI 大肠杆菌中，调控的强启动子特性。
在常规的不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为1 /.上通常还Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
lacI带有lacIq 基因，以表达更多有人认为在IPTG有一定毒性，IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是为IPTG作制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替30lacI 的温度敏感突变体，诱导物的研究。
另外一种研究方向是用成本低，物，度下抑制转录，42度开发。
IPTG诱导蛋白表达的原理之欧阳与创编
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基βD硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导蛋白表达全面介绍Word版
IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要 : 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。
中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。
使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。
然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
IPTG诱导表达步骤
大肠杆菌中蛋白质诱导表达
(一)材料
1. IPTG(用去离子水配成1 00mM，用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存)
2. 10xPBS缓冲液: NaCl 1.37 M
KCl 27 mM
Na2HPO4 100 mM
KH2PO420 mM
3. PMSF(用异丙醇配成10mM，-20℃保存)
4. 10% TritonX-100
(二)方法
1. 挑取单克隆接种于少量含有抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm震荡培养过夜;
2. 将过夜培养物按1:100的比例接种到新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,
250rpm震荡培养2-4h至OD600为0.5;
3. 加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续37℃, 250rpm震荡培养2-3h;
4. 4℃, 4000rpm离心10min后，去上清，加入适量IxPBS重悬，在加入PMSF至终浓度为
0.1 mM，冰上预冷10min;
5. 进行冰浴超声破碎5-10min (10-20sec/次)，至菌液较为澄清;
6. 加入10% TritonX-100至终浓度为0.5%, 4 ℃震荡15min;
7. 4℃, 12000rpm离心10min后，取上清:
8. 用相同体积的1 xPBS重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清
和沉淀分别进行蛋白电泳检测，考马斯亮蓝染色，脱色:
9. 根据脱色结果，可确定是否表达出目的蛋白，并且判断所表达的蛋白是可溶性还是以包
涵体形式存在。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
iptg诱导蛋白表达的最佳条件
IPTG诱导蛋白表达是实验室常用的一种方法，能够在原核细胞中诱导外源蛋白的表达。
通过IPTG诱导，可以控制外源蛋白的表达水平，并且能够在一定程度上避免细胞毒性。
下面我们来探讨一下IPTG诱导蛋白表达的最佳条件。
一、IPTG诱导蛋白表达的基本原理在大肠杆菌等原核细胞中，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）能够与lac操作子结合，从而激活lac重子基因，使得beta-半乳糖苷酶（β-galactosidase）表达升高。
而在真核细胞中，IPTG则不会起到任何作用。
IPTG在诱导原核细胞中的外源蛋白表达方面有着重要的应用价值。
二、IPTG诱导蛋白表达的影响因素1. IPTG浓度：IPTG浓度对蛋白表达水平有着直接的影响。
一般来说，较低的IPTG浓度能够减少蛋白表达对宿主细胞的负担，而较高的IPTG浓度则能够更快速地诱导蛋白表达。
2. 细胞培养温度：细胞的培养温度也会影响IPTG诱导蛋白表达的效果。
通常情况下，在37摄氏度下培养的细胞更容易被IPTG诱导，但在一些特殊情况下，低温培养也可以获得更高的蛋白表达水平。
3. 细胞培养时间：细胞在接受IPTG诱导后需要一定时间来表达目标蛋白。
合理的培养时间是保证蛋白表达效果的关键因素之一。
4. 细胞品系：不同的细胞品系对IPTG的敏感程度有所不同，选择合适的细胞品系也是影响蛋白表达效果的重要因素。
三、最佳的IPTG诱导条件1. IPTG浓度：一般情况下，我们可以在0.1-1mM的浓度范围内进行试验，以观察最佳的蛋白表达效果。
通常来说，0.1mM的IPTG浓度已经能够较好地诱导蛋白表达，而1mM的IPTG则能够更快速地达到最高表达水平。
2. 细胞培养温度：大多数情况下，将菌液在37摄氏度下培养12-16小时，然后经过IPTG诱导，再以28摄氏度温育4-6小时能够获得较好的蛋白表达效果。
3. 细胞培养时间：根据实验需要，通常在IPTG诱导后持续培养4-6小时，即可得到最佳蛋白表达效果。
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IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在PI 启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
材料
1、诱导表达材料
( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基
酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g
NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%
蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0
适用范围：大肠杆菌
( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS （电泳级）
0.1 ％溴酚蓝
10 ％甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 ）酶溶法
（1）裂解缓冲液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 ％溴酚蓝
20 ％甘油
实验方案
1、外源基因的诱导表达
( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，
确定无误后进行下一步。
( 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。
继续培养3 -5h 。
( 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 ）细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。
前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。
下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
（1）酶溶法。
常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。
溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。
主要步骤为：
① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。
弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。