医学病毒学登革热

miRNA RTqPCR分析证明了在 被编码vsRNA5的前体序列的 pIZ/pre-5转染72小时后的Aag2 细胞中存在vsRNA-5的异位表 达。pIZ是使用的载体.
对PCR的产物也进行了测序，以证明这种小RNA均一 性. 为了研究登革vsRNA5是否在DENV感染的哺乳动 物细胞中产生，我们用DENV-2感染了Vero细胞（来自 非洲绿猴）。RT-qPCR 证明了Vero细胞中小RNA的 表达，而且表达量随时间增大，最大值出现在感染七 天后。(如下图E).
以vsRNA5的5‘探针与 3‘TL探针以及vsRNA2的 探针，对转染了DENV-2病 毒3’UTR单链RNA的 Aag2细胞进行Northern blot 分析SS1 and SS2 展 示了不同转染形成的两个 克隆.
我们也用3‘TL探针和登革vsRNA2的探针进行了检测， 但是没有发现匹配的小RNA。进一步的，登革vsRNA5 的前体茎环结构也被克隆进pIZ/V5-His载体，转染入 Aag2细胞。成熟的登革vsRNA5在细胞中的合成已经通 过小RNA特异性的RT-qPCR进行了证明 （如下图Ｄ）。
M代表模拟感染。以U6RNA来 作为上样控制标准。箭头标明 了前体和成熟的vsRNA5
（这保证了登革vsRNA5并非RNAi的降解产物。）
为了进一步证明这一点，我们设计了另一个探针，这 个探针有21nt，与登革vsRNA5的前提茎环序列中的终 止环以及茎的之后的一条链上9个nt构成反相互补。用 这个探针进行检测，并没有发现匹配的小RNA（如下 图Ｂ3′TL probe） 。
感染DENV-2病毒后3、5、7天 的C6/36细胞以5‘探针进行 Northern blot 关于vsRNA5的 分析 (Left); 同样的分析也用 3‘TL为探针进行(Right).
进一步的，我们通过RT-PCR在通过两种不同途径感染7 天后的Aag2细胞中克隆到了登革vsRNA5前体茎环结构。 我们获得了93nt的序列，对应二型登革病毒基因组上 10298-10392位。为了调查登革vsRNA5在病毒感染期间 产生的过程，我们合成了451nt的DENV单链RNA，含有 3‘UTR，并转染入Aag2细胞中。Northern blot中5’探 针显示出明显的条带，对应了登革vsRNA5 (如下图C).
用小RNANorthen blot 的方法，分析了模拟感染、感染3， 5,7天的细胞中的总RNA，于感染后7天的细胞中发现了一 种23nt的小RNA(如下图Ａ)。这种小RNA与深度测序中发 现的小RNA大小相似。同时登革-vsRNA-5也同样在埃及 伊蚊的C6/36细胞系中被发现，其表达模式与被感染后７ 天的Aag2细胞相同（如下图Ｂ5′ probe）。另外其他的独 立的研究也发现C6/36细胞的RNAi通路是有缺陷的。
MicroRNA-like viral small RNA from Dengue virus 2 autoregulates its replication in mosquito cells Mazhar Hussain and Sassan Asgari1
DENV–vsRNA-5 Expression Analysis(登革–vsRNA-5Leabharlann Baidu表达分析)
感染DENV-2的哺乳动物细胞Vero中 对于vsRNA-5的miRNA RT-qPCR分 析，以5S rRNA为标准化的定量内 参。