掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
sanger测序的原理和步骤
Sanger测序，也被称为双脱氧链终止法，是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。
以下是其原理和步骤：
原理：
Sanger测序基于DNA聚合酶的DNA合成过程，通过添加双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）来终止DNA链的延伸，从而得到一系列不同长度的DNA片段。
ddNTP与普通dNTP的区别在于其3′端缺少一个羟基，这使得ddNTP在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。
通过在反应中加入四种不同的ddNTP，可以得到包含不同长度的DNA片段，从而揭示出DNA分子中核苷酸的顺序。
步骤：
DNA模板制备：从待测序的DNA样品中提取出目标DNA片段，并进行PCR扩增，得到足够的DNA模板。
DNA合成反应：在PCR扩增反应中，加入四种不同的dNTP和一种ddNTP。
由于ddNTP可以随机地终止DNA链的延伸，因此可以得到一系列不同长度的DNA片段。
电泳分离：将得到的DNA片段进行电泳分离，使不同长度的DNA 片段得以分离。
检测：通过放射自显影等技术对电泳结果进行检测，从而确定DNA 序列。
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因序列拼接和分析PPT课件
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合 物全部平行地点加在 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳， 每组制品中的各个组 分将按其链长的不同 得到分离，从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 基序列。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
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实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质技术主要有两种方法，都是 在20世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸 链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产 生切口，用同位素标记进行测序。
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6
2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上
述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷 三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然 后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机 地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继 续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A 就终止了。
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双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
DNA序列测定技术(Sanger双脱氧链终止法与Maxam-Gilbert DNA 化
DNA序列测定技术（Sanger双脱氧链终止法与Maxam－Gilbert DNA 化序列测定的技术和策略Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert DNA 化学降解法测序策略目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbe rt(1977)提出的化学降解法。
虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。
由于 DNA 上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA 全片段上的位置所决定。
然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA 分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA 上的核苷酸顺序。
一、Sanger双脱氧链终止法Sanger法DNA 测序的试剂引物模板DNA 聚合酶放射性标记的dNTPdNTP类似物现行的逻终止法人加减法序列测定技术（Sacger和Coulson，1975）发展而来的。
加减法首次引入了使用特异引物在DNA 聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DAN等3种方法。
尽管有了这些进展，但加减法仍然太不精确，也太不得法，因此难以广为接受。
直至引入双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等，1977 ），酶法DNA 序列测定技术才得到广泛应用。
2'，3'ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3' 位置缺少一个羟基。
它们可以在DNA 聚合酶作用下通过其5' 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，但由于没有3'羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA 链不可能继续延伸。
双脱氧终止法的原理(一)
双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。
它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。
•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。
2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。
这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。
dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。
•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。
反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。
•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。
DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。
•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。
•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。
碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。
电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。
•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。
•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。
3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。
•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。
DNA的测序方法、原理
3） DNA自动化测序
特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h
三种测序的比较
1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化 类似末端终止法，所 不同的是用荧光染料 标记，计算机自动读 出。
使用特异性引物与 用化学试剂在A、G、 单链模板DNA退火， C、T处特定的裂解 在DNA聚合酶作用 DNA片段，产生一簇 下进行延伸反应， 各种长度的短链，经 用ddNTP终止，用 过PAGE放射自显影 PAGE区分长度仅 可直读DNA顺序。 相差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成 测序的方法。 优点 简便、迅速、应用 广泛。
DNA的测序方法、原理
一、DNA序列测定
其基本原理是DNA 的复制反应体系中需要存在DNA 聚合 酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成 双链后，DNA 聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’ 的方向移动，dNTP 按照碱基配对原则，逐个连接在引物的 3’-OH 末端。
1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止 反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子， 从而来读取待测DNA分子的顺序。
不需酶促反应，可以 1、高负荷，1块胶可 对寡核苷酸测序。 测16个样品；2、机读 不需放射自显影；3、 安全不用同位素；4、 简单迅速8-10h。
用于终止反应的双脱氧核苷酸：
将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参 入到新合成的DNA链中，由于参入的 ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与下一位 核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反 应将中止。
DNA sequence
�
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Dye terminator reactions
- the primer is not labeled with a dye - the dye is attached to the dideoxynucleotide, so whenever a ddNTP is added by the polymerase, the fragment is labeled according to the ddNTP at the end -since labeling occurs with the addition of the ddNTP, only one reaction per template is needed
3.测序反应的种类
① 引物标记法(Dye primer reactions)
② 终止物标记法(Dye terminator reactions)
Dye primer reactions
-fluorescent dye( label) on the primer, one specific dye for each nucleotide to be identified (A, C. G, T) -four separate reactions couple each specific primer with the corresponding ddNTP
序列测定 第9章 DNA序列测定 章 序列
遗传与分子生物学系 于杰 yujie19601117@
DNA 序列测定方法
1. Sanger 双脱氧链终止法 2. Maxam-Gilbert 化学修饰法
第一节 Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method)
双脱氧终止法测序的原理
双脱氧终止法测序的原理双脱氧终止法测序，听起来是不是有点复杂？其实它就像一场科学界的精彩戏剧，让我们一起看看这个有趣的过程吧！这种测序方法的名字就有点意思，“双脱氧”听上去像是什么魔法药水，其实它是DNA的基本构件之一。
想象一下，DNA就像一条长长的双螺旋楼梯，而我们要做的，就是找出这条楼梯上每一步的秘密。
说白了，就是要弄清楚DNA里面的“字母”是什么。
好了，首先要准备一些小助手，叫做“脱氧核苷酸”，这些小家伙是DNA的拼图块，它们有四种，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
这个时候，我们的主角“DNA模板”登场了，科学家们会把要测序的DNA分子放进去，然后加上这些脱氧核苷酸。
听到这，你是不是有点兴奋？就是关键时刻，加入了特殊的“终止剂”，就像在比赛中设立了终点线。
这时候有趣的事情发生了！终止剂会和脱氧核苷酸结合，导致DNA合成在某个特定位置停止。
就像我们在聚会上跳舞，忽然DJ放了一首慢歌，大家都停下来了。
这个停下来的点，正好就是我们需要记录的“字母”。
科学家们用各种方法把这些终止的DNA 片段分开，然后再进行分析，最终把每一个“字母”都一一拼凑起来。
可能有些朋友会问了，这种方法有什么特别之处呢？双脱氧终止法是非常准确的，就像精致的钟表，能精确到每一秒。
这种方法的发明者还因此获得了诺贝尔奖，真是值得点赞！这种测序方式的应用可广泛了，比如在医学上帮助我们了解基因病，或者在考古学上让我们找到古老DNA的秘密。
多么令人兴奋的科学探索啊！这一切的背后，都离不开科学家们的努力。
想象一下，他们在实验室里穿着白大褂，手里拿着各种设备，脸上挂着认真又兴奋的神情。
为了一个个数据，他们可谓是绞尽脑汁，有时候甚至会遇到意想不到的挑战。
比如，可能会出现一些干扰因素，影响测序的准确性，这时候就得重新审视整个过程，确保每一步都走得稳稳当当。
双脱氧终止法测序就像是科学界的一场大冒险，既有挑战又有惊喜。
每一个字母的拼凑，都像是解开了一道道谜题，让我们更加了解生命的奥秘。
核酸的核苷酸序列测定方法
核酸的核苷酸序列测定方法一、Sanger双脱氧链终止法1、基本原理：将2'3'-双脱氧核苷酸（ddNTP）掺入到新合成的DNA链中，由于ddNTP缺乏3'-OH，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应终止。
2、基本步骤：进行四组平行反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。
这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA 的核苷酸序列。
【例如】：某一个DNA分子, 互补序列是GATCCGAT:①在第一个反应体系中加入dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA,②在第二个反应体系中加入dNTP+ddCTP,产生的都是以C结尾的片段:GATC, GATCC,③在第三个反应体系中加入dNTP+ddGTP,产生的都是以G结尾的片段:G, GATCCG④在第四个反应体系中加入dNTP+ddTTP,产生的都是以T结尾的片段:GAT, GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列, ①反应体系中的片段长度为2, 7; ②反应体系中的为4, 5;③反应体系中为1, 6; ④反应体系中的为3, 8, 四个反应体系的产物分别电泳, 结果为：87654321 。
双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分析
主要的blast程序
程序名 Blastn Blastp
查询序列 核酸
蛋白质
Blastx
核酸
Tblastn 蛋白质
TBlastx 核酸
数据库 核酸
蛋白质 蛋白质
核酸 核酸
搜索方法
核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的 序列
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白 质数据库中的序列逐一搜索。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
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荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
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Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： 手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约1200 bp。
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同理第二个反应产生的都是以C结 尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个 反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序 列了.
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假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以 产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果 是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可 以继续延伸, 产生GATCCGAT.
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2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。
其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。
DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。
通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。
ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。
在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。
在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。
通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。
二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。
1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。
简述双脱氧法测序的原理
简述双脱氧法测序的原理双脱氧法测序（Double-stranded DNA Sequencing）是一种常用的DNA测序方法，也是基因组学和生物学研究中最重要的技术之一。
它通过测量DNA链中的不同核苷酸的排列顺序，来确定DNA序列。
双脱氧法测序的原理相对简单，以下将详细介绍。
让我们先了解DNA的结构。
DNA由四种不同的核苷酸组成，分别是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。
DNA的两条链通过互补配对相互连接，其中A与T互补，G与C互补。
这种互补配对的规则使得DNA能够复制和传递遗传信息。
在双脱氧法测序中，首先需要将待测序列DNA复制成许多不同长度的片段。
这一步骤通常通过聚合酶链式反应（PCR）来实现。
PCR可以在体外将DNA特异性地扩增为大量的复制产物。
这些片段将被用作测序的模板。
接下来，使用DNA聚合酶和DNA引物，进行测序反应。
在每个反应中，会加入四种不同的二脱氧核苷酸（ddNTPs），它们与正常的四种脱氧核苷酸（dNTPs）类似，但在化学结构上有所不同。
ddNTPs缺少3'端的羟基，因此无法继续延伸DNA链。
当ddNTPs被加入反应体系中时，DNA聚合酶会随机地在不同的位置停止合成新的链。
在反应中，还会加入大量的dNTPs，其中包含有荧光染料。
这些染料在不同的颜色中发出荧光，并且每种颜色对应一种不同的ddNTPs。
当DNA聚合酶在某个位置停止合成链时，它会在该位置加入一个ddNTPs，从而导致DNA链的终止。
通过PCR扩增得到的DNA片段具有不同的长度，因此在测序反应中，会产生一系列以不同长度终止的DNA片段。
这些片段经过电泳分离，将具有不同长度的片段分离开来。
分离过程中，使用荧光探测器来检测每个片段的荧光信号，并记录下来。
根据荧光信号的顺序，可以确定每个片段的长度和终止核苷酸的类型。
通过将这些片段的顺序按照长度的从小到大重新排列，就可以获得DNA的完整序列。
双脱氧法测序的优点在于其简单、高效、可靠。
Sanger测序原理与方法
Sanger测序原理与方法在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。
目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。
快速DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。
测序原理利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，终止点由反应中相应的双脱氧而定。
测序方法基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR 产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
测序设备DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)，性能特点，自动化程度高，提供连续、无需监控的操作，自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析，可连续运行24小时无需人工干预。
DNA序列测定PPT课件
donghua
.
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PCR法
直接测序 循环测序
.
的DNA序 列。
首先通过PCR从样品中扩增出目的DNA
随后通过电泳将扩增产物的双链DNA同反应剩 余的dNTP及引物分开，回收PCR扩增的DNA 片段。
对扩增产物进行测序反应。测序引物可以是扩增 靶DNA一对引物中的一条，也可以是能与PCR 产物杂交的其他引物。
⑤
3， ddTGCAGGC
3， ddTCTGCAGGC
加ddTTP /klenow片断3， ddTAATCTGCAGGC
5， 5，
⑥ 加在序列
胶之T行
5，
④
⑤
加ddGTP /klenow片断
3， ddGC 3， ddGGC 3， ddGCAGGC
5， 5，
⑥ 加在序列
胶之G行
5，
④
⑤
加ddCTP /klenow片断
G A+G C+T C A>C
pH8.0 下 ， 用 硫 酸 二 甲 酯 对 N7 进 行 修 饰 ， 使C8-C9键对碱基裂解具有特异的敏感性
pH2.0哌啶甲酸使嘌呤环的N原子质子化， 导致脱嘌呤，消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键
肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后 易于除去 在1.5mol/L NaCl存在下，只有胞嘧啶可与 肼发生明显可见的反应 在90℃，用1.5mol/L NaOH处理，可使A 位点发生剧烈断裂反应，而C位点断裂反应 微弱
3， ddC 3， ddCAGGC 3， ddCTGCAGGC
.
5， 5，
⑥ 加在序列
胶之C行
5，
6
单链模板DNA
ddTTP
引物 ddCTP ddGTP ddATP
双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
EDTA
乙二胺四乙酸，
一种二价金属
离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
聚丙烯酰胺凝胶电泳
95℃加热 变性
冰上冷却 点样
开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
放射自显影
ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。
聚丙烯酰胺凝胶电泳特点
精度相当高！ 能分离长度达 300-500个碱基， 而差别仅一个 碱基的同系单 链核苷酸序列。
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
加加 热入 ，引 退物 火，
带引物的模板标记的dNTP
分成四管 双 双 双双 脱 脱 脱脱 氧 氧 氧氧 鸟 腺 胸胞 苷 苷 苷苷
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
Frederick Sanger
双脱氧末端终止法
双脱氧链端终止法
双脱氧链端终止法
双脱氧链端终止法（Double-dideoxy chain termination method），也称为Sanger法，是一种常用的DNA测序技术。
该方法通过使用带有特殊标记的二脱氧核苷酸（ddNTPs）来终止DNA合成过程，从而确定DNA序列。
在双脱氧链端终止法中，DNA片段作为模板，酶（如DNA聚合酶）和引物被加入到反应体系中。
该体系中还加入了四种常规的脱氧核苷酸（dNTPs），以及四种带有不同荧光标记的二脱氧核苷酸（ddNTPs）。
ddNTPs会在DNA合成过程中发生随机终止，从而产生不同长度的DNA片段，每个终止位置对应一种ddNTP。
反应混合物中的DNA片段随后被分离并利用凝胶电泳技术进行分析。
通过观察在不同波长下的荧光信号，可以确定每个ddNTP的终止位置，从而推断出DNA序列。
双脱氧链端终止法具有高度准确性和可靠性，广泛应用于DNA测序、基因组学研究、致病基因检测等领域。
该方法的原理和步骤相对简单，但是处理大规模样本时工作繁琐，且测序长度有限。
因此，在现代基因组学研究中，已有更先进的测序技术替代了双脱氧链端终止法，例如高通量测序技术（如Illumina 测序、Ion Torrent测序等）更快速、高效。
DNA测序测序方法双脱氧链终止法自动化DNA测序焦磷酸测序1
DNA 测序测序方法：双脱氧链终止法自动化DNA测序焦磷酸测序1、双脱氧链终止法原理：ddNTP由于缺乏3’-OH ，可以终止DNA链的延长利用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将不同长度的核苷酸链分离步骤：（1）双链DNA-------加热----------单链DNA（2）加引物--------退火（3）取四支试管A、B、C、D加入dNTP、耐热的DNA聚合酶（4）将ddNTP标记，A加入ddATP、B加入ddTTP、C加入ddCTP、D加入ddGTP（5）得到结构如下5’—X—A*5’—X—AG*5’—X—AGG*5’—X—AGGC*5’—X—AGGCT*5’—X—AGGCTA*5’—X—AGGCTAG*5’—X—AGGCTAGC*5’—X—AGGCTAGCA*5’—X—AGGCTAGCAG*5’—X—AGGCTAGCAGC*5’—X—AGGCTAGCAGCA*5’—X—AGGCTAGCAGCAT*5’—X—AGGCTAGCAGCATG*5’—X—AGGCTAGCAGCATGA*（6）用尿素处理变性的聚丙烯凝胶电泳，依次读出核苷酸序列2、自动化DNA测序原理：(1)用四种不同的荧光染料分别标记不同的ddNTP(2)在同一试管中加入ddNTP、NTP、DNA单链-引物、DNA聚合酶(3)生成的系列单链DNA片段在琼脂糖凝胶进行电泳(4)用光子检测器接受被激光激发的DNA上的标记荧光素发出的光子，因生成的DNA依据片段由短到长依次经过，便可得到待测DNA的核苷酸序列3、焦磷酸测序原理：（1）将单一链DNA-引物、DNA聚合酶、ATP硫酶化酶、荧光素酶、荧光素、APS加入试管（2）加入一种dNTP，如果其为合成下游核苷酸所需要的核苷酸种类，则发生反应生成PPi（3）P pi在ATP硫酶化酶作用下生成ATP（4）A TP在荧光素氧化酶的作用下将荧光素氧化生成氧化荧光素（5）氧化荧光素释放光子恢复形成荧光素，（6）剩余的dNTP在APS作用下继续分解（7）加入另一轮dNTP，进行新一轮反映。
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[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。
由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。
本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。
实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。
每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。
但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。
例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。
将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。
其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。
由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。
故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。
[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。
(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。
2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。
(2)另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。
依次将A-Mix、G-Mix、C-Mi x和T-Mix液各2.5μl分别加入这4只微量离心管中，置37℃预温1分钟以上(说明：4种mix 液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于<500bp的DNA片段的测序，后者用于50-1000bp片段的测序。
一般应用short即可)。
(3)标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14μl(已有)；标记用混合物(1abellingmix)3μ1；已标记混合物(1abelled mix)1μ1，T7DNA聚合酶稀释液2μ1。
总体积2 0μ1。
轻轻混匀，简短离心，置室温5分钟，立即接下步反应。
(4)从“标记反应”混合物中，分别取4.5μl加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。
简短离心，37℃保温5分钟。
(5)向每只离心管中加入5μl反应终止液，混匀，简短离心。
(6)变性反应：在电泳前进行。
在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4℃。
另取4只微量离心管，标好“A”、“G”、“C”和“T”。
从上述每一链延长/终止反应的试管中取3μ1，分别加入4只已标号的相应微量离心管中，75-80℃加热2分钟，立即各取1.5-2μ1点样、电泳。
3．制备电泳凝胶及电泳(1)制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾“洗洁净”液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel-silane)将玻板的—面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥(注意：清洗时应戴一次性手套操作)。
将其中一块玻板平置台上(硅烷处理过的—面朝上)，两侧各放置一条隔离条(最好选用上方厚为0.2mm，下方厚0.4mm的楔形条)，另取—块玻板(硅烷化处理过的—面朝下)，对准放置在上述玻板上，两侧及—面边缘用胶带封严，并用文具夹夹紧，制成胶模。
(2)配制电泳凝胶：向1只100ml烧杯中加入下列试剂；20%丙烯酰胺溶液20ml；10×TB E缓冲液5ml；46.7%尿素溶液25ml。
总体积50ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。
混匀，过滤除去不溶物，置100ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟，加入250μl 10%过硫酸铵，50μlTEMED 混匀。
(3)注胶：立即将配好的凝胶用50ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右)，注意防止气泡，如有气泡产生，可敲击该部位玻璃，使气泡上升排除。
从上面插入梳齿背，深入胶面约10-12mm。
将胶模水平放置45-60分钟，待凝胶聚合。
(4)电泳：凝胶聚合后，拨掉梳齿，撕去玻板下缘胶带，用蒸馏水淋洗凝胶表面，以除去未聚合物质。
将胶板装置在电泳槽上，上下槽加入缓冲液，注意排除凝胶下缘气泡。
接通电源，4 0W预电泳45-60分钟。
预电泳结束后，断电。
插入样品梳，梳齿向下插入凝胶中3mm左右。
用缓冲液小心冲洗每一加样小槽(齿间空隔)，用记号笔标明A、G、C和T4个小槽，每槽加入变性后的链延伸/终止液1.5-2μl。
接通电源，40W恒压，电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。
如待测片段较长而需继续点样，则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5cm时切断电源，用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔1-2个加样小槽)，重复上样操作，然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电，停止电泳。
4．放射自显影及结果分析将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。
可将凝胶切下一小角以示方向。
在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。
滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。
于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。
然后由下而上读序。
[注意事项]1．操作顺序参考表(1)制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。
(2)检查实验计划及试剂。
(3)预电泳。
(4)预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。
(5)点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。
(6)固定、干燥凝胶。
(7)放射自显影。
2．M13重组子的培养(1)挑取单一的大肠杆菌集落加入3ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。
(2)取200μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测D NA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。
(3)通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。
存放4℃待用。
3．单链模板的分离(1)沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。
离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。
小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。
(2)分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100μl，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。
再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。
小心将上层液转移至另—干净离心管中。
用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。
加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。
加1/10体积3mol/L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。
加入20μlTris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。
用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。
[试剂与器材]1．试剂(1)退火缓冲液：1mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00mmol/L MgCl2和160mmol/L DTT。
(2)通用测序引物：5’-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3’，在水溶液中(5pmol/μl)。
(3)T7DNA聚合酶(8ug/μl)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃，用时吸取1份后迅速放回。
稀释液可在4℃保存l周。
(4)酶稀释缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L DTT，100 u g牛血清白蛋白/ m1，5%甘油。
(5)标记用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375μm，333.5mmol/L Na Cl。
(6)模板：l0μg单链M13mpl8DNA在50μ1Tris-EDTA缓冲液中。
(7)“A”mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/L dATP，14μmol/L dd ATP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L NaCl(8)“G"mixshort；dATP，dCTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/LdGTP，14μmol/L dd GTP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl(9)"C"mixshort：dATP，dGTP和dTTP各840μM，93.5μmol/LdCTP，14μmol/L ddCTP，40mmol/L Tris- HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(10)"T/mixshort：dATP，dCTP和dGTP各840μmol/L，93.5μmol/L dTTP，14μmol/L d dTTP，40mmol/L TrisHCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(11)终止液：溴酚蓝和二甲苯腈蓝FF各3%，l0mmol/L EDTA(pH7.5)，97.5%去离子甲酰胺。
(12)标记脱氧核苷酸：[α-32P]dATP，10mci/m1，3000ci/mmol。
说明：除试剂12购自Amersham公司外，其余上述试剂均包括在Pharmacia Biotech公司的T7SequencingTMKit试剂盒内。
(13)显影剂(14)定影剂2．器材恒温加热器或恒温水浴槽；涡旋振荡器；台式高速离心机；恒功率电泳仪；测序用电泳槽(附玻板及隔离条)盖革计数器；可调式加样器；微量离心管(Eppendorf管)；胶带；剪刀；手术刀；烧杯(100ml)；梨形瓶(100ml)；水泵；注射器(50ml)；注射器针头(18号)；新华滤纸(3号)或Whatman 滤纸(1号)；保鲜膜；凝胶干燥器材；抽气泵；增感屏；X光胶片；显影及定影用具。