双脱氧末端终止法测序
双脱氧末端终止法测序
双脱氧末端终止法测序双脱氧末端终止法测序是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。
如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分四个泳道进行电泳。
以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dA TP，例如?32 PdA TP 和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。
当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。
ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddA TP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。
所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。
根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。
(二) 双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例）。
dna双脱氧末端终止法名词解释
DNA双脱氧末端终止法1. 介绍DNA双脱氧末端终止法（DNA double-stranded termination method），简称为双脱氧法，是一种用于测定DNA序列的方法。
它是由弗雷德里克·桑格和沃尔特·吉尔伯特于1977年首次提出的。
该方法通过在DNA合成过程中加入一种特殊的二进制末端标记物，使得DNA合成在特定位置停止，从而确定目标DNA序列。
2. 原理DNA双脱氧末端终止法的原理基于DNA链延伸和合成的过程。
在实验中，需要使用一小段已知序列的DNA作为引物（primer），通过引物与待测DNA序列的互补配对，引导DNA聚合酶（DNA polymerase）在待测序列上进行链延伸和合成。
为了标记终止位点，实验中会加入四种不同的二进制末端标记物：A、T、C、G（即脱氧核苷三磷酸）。
这些标记物与待测序列中下一个碱基互补配对，并由聚合酶添加到扩增链上。
然而，在添加完一个脱氧核苷三磷酸后，聚合酶无法再添加新的核苷酸，导致DNA链的终止。
在实验中，会同时进行四个反应管，每个反应管中只加入一种特定的脱氧核苷三磷酸。
通过控制不同脱氧核苷三磷酸的浓度和添加顺序，可以得到标记了不同碱基的DNA片段。
这些片段经过电泳分离后，就可以得到一个带有不同长度的DNA序列。
3. 实验步骤DNA双脱氧末端终止法包括以下几个主要步骤：3.1 DNA提取和纯化首先需要从待测样品中提取出目标DNA，并进行纯化以去除杂质。
这通常涉及到细胞裂解、蛋白酶处理、有机溶剂萃取等步骤。
3.2 引物设计和合成根据已知的目标序列设计引物，并通过化学合成方式合成引物。
引物通常由15-30个碱基组成，并具有与待测序列互补的区域。
3.3 PCR扩增将待测DNA与引物一起加入PCR反应体系中，通过多轮循环扩增，使得目标DNA序列得到大量复制。
PCR反应包括DNA变性、引物结合和扩增等步骤。
3.4 标记DNA片段在PCR反应中加入四种不同的脱氧核苷三磷酸（A、T、C、G），使得DNA链的合成在特定位置停止。
dna双脱氧末端终止法名词解释
DNA双脱氧末端终止法一、引言DNA双脱氧末端终止法（DNA double-stranded termination method），又称为Sanger测序法（Sanger sequencing），是一种经典的测序技术，于1977年由Frederick Sanger等人首次发表。
它是一种利用DNA聚合酶合成DNA链过程中的特殊终止作用分析DNA序列的方法。
本文将从原理、步骤、优缺点等方面对DNA双脱氧末端终止法进行详细的解释和探讨。
二、原理DNA双脱氧末端终止法基于DNA聚合酶的特殊性质，即当DNA聚合酶在合成DNA链过程中遇到双脱氧末端核苷酸（ddNTP）时，合成过程会终止。
与普通核苷酸（dNTP）不同，双脱氧末端核苷酸缺少3’位的羟基，无法连接到新的核苷酸，导致DNA链的延伸终止。
根据不同的碱基，分别使用带有不同荧光标记的ddNTP，例如A荧光标记的ddATP、C荧光标记的ddCTP、G荧光标记的ddGTP和T荧光标记的ddTTP。
将DNA模板与DNA聚合酶、引物、dNTP和ddNTP一起反应，可以合成出含有不同长度的DNA片段。
通过将反应产物进行电泳分离，并利用自动DNA测序仪检测不同荧光标记的信号，就可以得到DNA序列。
三、步骤DNA双脱氧末端终止法包括以下主要步骤：1. PCR扩增首先需要从待测DNA样本中进行PCR扩增，以获得足够数量的DNA模板。
PCR扩增可以使用特定引物选择性地扩增目标DNA片段，增加检测的敏感性和特异性。
2. 反应体系制备在反应管中将PCR产物与适量的DNA聚合酶、引物、dNTP和荧光标记的ddNTP混合，制备合适的反应体系。
其中不同颜色荧光标记的ddNTP分别代表A、C、G和T。
3. DNA链合成将反应体系进行热循环反应，通过不断提高和降低温度，使DNA链聚合酶合成DNA 链。
在这个过程中，当聚合酶遇到带有荧光标记的ddNTP时，会发生终止，形成不同长度的DNA片段。
掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。
由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。
本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。
实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。
每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。
但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。
例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。
将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。
其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。
由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。
故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。
[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。
(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。
2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因序列拼接和分析PPT课件
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合 物全部平行地点加在 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳， 每组制品中的各个组 分将按其链长的不同 得到分离，从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 基序列。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
1
实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质技术主要有两种方法，都是 在20世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸 链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产 生切口，用同位素标记进行测序。
5
6
2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上
述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷 三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然 后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机 地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继 续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A 就终止了。
13
双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
sanger双脱氧链终止法(酶法)进行dna测序的原理
sanger双脱氧链终止法(酶法)进行dna测序的原理Sanger双脱氧链终止法（酶法）进行DNA测序1. 简介•DNA测序是基因组研究中一项非常重要的技术，它能够帮助我们了解生物体的基因组结构和功能。
•Sanger双脱氧链终止法（酶法）是一种经典的DNA测序方法，已被广泛应用于科学研究和医学领域。
2. 原理概述•Sanger测序法基于DNA复制的酶法原理，通过DNA聚合酶合成DNA链的特性进行测序。
•DNA链延伸是通过DNA聚合酶酶作用于DNA模板上的dNTPs（脱氧核苷三磷酸）完成的。
•Sanger测序法借用了可逆的链终止末端ddNTPs（二氧基脱氧核苷三磷酸），这些分子能够终止聚合酶的合成反应。
3. 酶法测序步骤1.准备DNA样本：从待测序的DNA源中提取出目标DNA序列样本。
2.PCR扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）方法扩增目标DNA序列，以增加样本量。
3.制备反应混合物：将PCR产物与引物（DNA聚合酶合成起始点）和ddNTPs（链终止末端）混合。
4.DNA链延伸：酶法测序反应包括多轮的DNA链延伸，每轮延伸引入一种类型的ddNTPs。
5.DNA片段分离：对于每轮延伸，所得到的DNA片段根据长度差异进行凝胶电泳分离。
6.凝胶电泳：通过凝胶电泳将DNA片段按照长度从短到长进行排序。
7.结果分析：根据电泳结果，识别DNA片段，从而得到目标DNA序列。
4. Sanger测序的限制和发展•Sanger测序法的主要限制在于对于较长DNA序列的测序效率低下。
•随着测序技术的发展，高通量测序技术如Illumina测序和流式显微镜测序已经取代了Sanger测序在大规模基因组测序中的地位。
•然而，Sanger测序法在小规模测序和验证实际应用中仍然具有重要性。
5. 总结•Sanger双脱氧链终止法（酶法）是一种经典的DNA测序方法。
•这一方法通过聚合酶合成DNA链的特性以及使用ddNTPs酶法终止聚合酶反应，实现了DNA的测序。
双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分析
主要的blast程序
程序名 Blastn Blastp
查询序列 核酸
蛋白质
Blastx
核酸
Tblastn 蛋白质
TBlastx 核酸
数据库 核酸
蛋白质 蛋白质
核酸 核酸
搜索方法
核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的 序列
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白 质数据库中的序列逐一搜索。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
14
荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
15
16
Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： 手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约1200 bp。
7
同理第二个反应产生的都是以C结 尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个 反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序 列了.
8
假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以 产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果 是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可 以继续延伸, 产生GATCCGAT.
5
6
2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
5DNA分析技术
ssDNA
Primer Klenow dNTPs ddTTP
A
C
G
T
DNA聚合反应
5.2、Maxam-Gilbert化学降解法
一、基本原理：
化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上的。
在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反
二、双脱氧末端终止测序法基本反应主要步骤：
1.单链DNA模板的制备。
2.DNA模板与测序引物退火。 3.掺入法标记反应。 4.延伸-终止反应。 5.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6.放射自显影。
7.阅读测序结果。
测序反应过程
三、双脱氧末端终止测序法的基本反应：
GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA 5' P OH 3'
5、DNA序列分析
DNA双螺旋结构解明之后，研究基因组中每一个基因的作用成 为主要课题。为此，首先必须设法知道目的基因的核苷酸排列顺序
，即基因测序。基因测序是基因操作最基本技术之一。
目前基因测序主要有两种方法：Sanger双脱氧末端终止测序法 和Maxam-Gilbert化学降解法。
5.1、双脱氧末端终止测序法 一、双脱氧末端终止测序 法的基本原理：
DNA链聚合反应时定点随 机中断依赖于特殊的反应
底物——2’、3’-双脱氧核
苷三磷酸（ddNTP）
ATP、dATP和ddATP的结构示意图
DNA合成反 应模式图
一、双脱氧末端终止测序法的基本原理：
在DNA合成反应体系中，含有正常脱氧核苷三磷酸(dNTPs)底物 和少量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)特殊底物，由于这种底物的5′-
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。
其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。
DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。
通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。
ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。
在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。
在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。
通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。
二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。
1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。
双脱氧终止法测序原理
DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段:GA, GATCCGA,同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段:GATC, GATCC,在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:G, GATCCG在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:GAT, GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为8 7 6 5 4 3 2 1A | |C | |G | |T | |我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成。
5DNA分析技术
A
C
G
T
Klenow
T T TT
dNTP + ddATP
T T
5' P
OH 3'
四、双脱氧末端终止测序法的基本操作
测 序 反 应 产 物 电 泳 区 带 放 射 自 显 影
ssDNA
Primer Klenow dNTPs ddATP
ssDNA
Primer Klenow dNTPs ddCTP
ssDNA
三、基本步骤
1.目的DNA的制备；
2.单侧末端标记待测DNA片段：5`磷酸基团；
3.碱基的特异性修饰及化学降解；
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳；
5.放射自显影阅读分析结果。
MaxamGilbert 化学降解法 原理示意图
化学降解G反应 模式图
化学降解反应产物电泳区带放射自显影示意图
5.3、DNA序列分析的自动化
二、Maxam-Gilbert化学降解反应的化学试剂和化学反应
碱基体系 G A+G C+T C A>C 化学修饰剂 硫酸二甲酯 哌啶甲酸 肼 肼+NaCl 90℃，NaOH 化学反应 甲基化 脱嘌呤 打开嘧啶环 打开胞嘧啶环 断裂反应 断裂部位 G G和A C和T C A和C
*哌啶在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂
二、双脱氧末端终止测序法基本反应主要步骤：
1.单链DNA模板的制备。
2.DNA模板与测序引物退火。 3.掺入法标记反应。 4.延伸-终止反应。 5.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6.放射自显影。
7.阅读测序结果。
测序反应过程
三、双脱氧末端终止测序法的基本反应：
GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA 5' P OH 3'
双脱氧链终止法原理
双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法（又称Sanger法）是一种通过测序DNA分子中的核苷酸序列的方法。
它是由Frederick Sanger在1977年首次提出的，因此得名。
这种方法是通过测定DNA链的末端来确定其序列，是DNA测序的重要技术手段之一。
在双脱氧链终止法中，首先需要将待测DNA分子进行复制，得到一系列长度不同的DNA分子。
然后，将这些DNA分子与一种特殊的双脱氧核苷酸（ddNTP）一起进行反应。
这种特殊的ddNTP与普通的脱氧核苷酸（dNTP）相比，它在连接上缺少了一个3'羟基，因此无法再延长DNA链。
在反应过程中，当DNA链合成到ddNTP时，反应就会终止，形成一系列长度不同的DNA分子。
接下来，需要将这些终止的DNA分子进行分离和检测。
一般来说，可以通过凝胶电泳的方法将这些DNA分子按照长度进行分离。
然后，可以利用放射性同位素或荧光标记的探针来检测DNA分子的长度和序列。
通过测定不同长度的DNA分子，就可以确定原始DNA链的序列。
双脱氧链终止法的原理相对简单，但是在实际操作中需要高度的精确度和技术要求。
首先，需要保证DNA链的复制过程尽可能准确，避免出现错误的复制。
其次，需要保证ddNTP的浓度和反应条件的控制，以确保反应能够在正确的位置终止。
最后，需要对终止的DNA分子进行准确的分离和检测，以得到准确的测序结果。
双脱氧链终止法在DNA测序中具有重要的应用价值。
它可以用于测定DNA分子的序列，帮助科学家们研究基因的结构和功能，以及进行基因工程和遗传学研究。
同时，双脱氧链终止法也为医学诊断和药物研发提供了重要的技术手段。
总的来说，双脱氧链终止法是一种重要的DNA测序技术，通过对DNA分子进行复制、终止和检测，可以帮助科学家们准确地测定DNA分子的序列，为基因研究和医学应用提供重要的支持。
双脱氧末端终止法测序的原理
双脱氧末端终止法测序的原理双脱氧末端终止法测序，也称为Sanger测序法，是一种经典的DNA测序方法，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究中。
该方法的原理是利用DNA聚合酶在DNA合成过程中加入的一种特殊的二进制分子，即二进制脱氧核苷酸（dideoxynucleotide），来终止DNA链的延伸，从而得到一系列以不同二进制脱氧核苷酸为终止点的DNA片段。
通过测定这些DNA片段的长度和顺序，进而推导出原始DNA序列。
在双脱氧末端终止法测序中，首先需要将待测序列DNA分离成单链，并制备出一系列的DNA模板。
这些DNA模板中包含了待测序列DNA的不同长度的延伸片段，并且每个片段的延伸末端都是以一种特定的二进制脱氧核苷酸（ddNTP）为终止点。
这些ddNTP 与普通的脱氧核苷酸（dNTP）只有一个氧原子的差异，这个氧原子的缺失使得在DNA链的延伸过程中无法再连接新的核苷酸，从而终止了DNA链的生长。
接下来，将DNA模板与DNA聚合酶、DNA引物和dNTPs（包括普通的脱氧核苷酸和ddNTPs）一起放入反应体系中。
DNA聚合酶会根据DNA模板的序列，选择配对的dNTPs与DNA模板上的碱基进行连接，形成新的DNA链。
当DNA聚合酶遇到ddNTP时，由于ddNTP的特殊结构，无法与DNA模板上的碱基进行连接，因此DNA链的延伸被终止。
在反应结束后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，可以将不同长度的DNA片段分离开来。
然后，根据片段的大小顺序，可以推断出原始DNA序列。
由于每个终止点对应的ddNTP是特定的，因此可以通过识别终止点所对应的ddNTP，来确定原始DNA序列中相应位置的碱基。
双脱氧末端终止法测序具有一定的优势。
首先，该方法可以对较长的DNA片段进行测序，通常可以测序500至1000个碱基。
其次，该方法的准确性较高，错误率通常在1%以下。
此外，该方法操作简单，所需的设备和试剂相对较少，适用于大规模测序。
双脱氧末端终止测序法原理_过程和目标基因cDNA序列拼接和分析课件
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
14
荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
15
16
Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： • 手工测序：最大约300 bp； • 自动测序：最大约1200 bp。
39
6.限制条件，我们限 制在病毒里面找。
7.其他选项保持默认 值
打分矩阵
40
8.输出格式选项保持 默认值
9.点击开始搜索
41
10.查询序列的一些 相关信息
在cdd库里面找到 两个保守区域，
点击可以进入
42
图形结果
43
匹配序列列表
44
具体匹配情况
45
思考题
1. 序列的同源性和相似性有什么区别？ 2. 在网上查询一个序列信息的步骤有哪些？
24
主要的blast程序
程序名 Blastn Blastp
查询序列 核酸
蛋白质
Blastx
核酸
Tblastn 蛋白质
双脱氧末端终止法测序全解
快速序列测定：双脱氧末端终止法06级生科A班苏狄 064120202摘要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。
关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。
虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。
然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。
DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。
双脱氧末端终止法测序一、原理双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。
其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH 末端生成3′,5′-磷酸二酯键。
sanger双脱氧链末端终止法的原理
Sanger双脱氧链末端终止法是一种用于测序DNA的方法，是20世纪70年代由Frederick Sanger等人开发出来的。
本文将从原理、流程、应用以及优缺点等方面对Sanger测序法进行详细介绍。
一、原理Sanger测序法基于DNA合成原理，利用由两种特殊的脱氧核苷酸（dideoxynucleotide）引起的结果链的延伸中止现象来确定DNA序列。
1. 脱氧链末端终止原理在Sanger测序法中，DNA序列是通过DNA聚合酶在存在四种常规脱氧核苷酸（dNTP）和一种具有特殊结构的脱氧核苷酸（ddNTP）的情况下进行合成的。
ddNTP与dNTP相比，多了一个氧原子，这个氧原子使得其在DNA链延伸后不能再连接下一个核苷酸，因此会导致DNA链的延伸中止。
而因为每个ddNTP只有一种特定的脱氧核苷酸（A、T、C、G），所以在反应体系中同时添加了四种不同的ddNTP，使得DNA链在每个具体的位置都有一种ddNTP参与，从而导致DNA在该位置处的延伸中止。
二、流程Sanger测序法一般包括以下几个步骤，主要包括DNA样本提取、DNA片段化和标记、DNA片段分离、片段电泳和数据分析等环节。
1. DNA样本提取首先需要从待测DNA样本中提取DNA，获得目标DNA片段。
2. DNA片段化和标记将目标DNA片段通过PCR或限制酶水解等方法，得到一系列不同长度的DNA片段。
根据Sanger测序法的原理，在DNA片段延伸过程中加入特殊标记，用以标记不同的核苷酸。
3. DNA片段分离将标记好的DNA片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行分离，分离后的DNA片段会形成由短至长的条带。
4. 片段电泳将分离好的DNA片段通过电泳进行分离，根据不同碱基对应的标记，确定不同DNA片段的长度，并形成相应的电泳图谱。
5. 数据分析通过测序仪或者其他相关设备获取电泳图谱，并用相应的软件进行数据分析和序列读取，从而得到目标DNA片段的序列。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
快速序列测定：双脱氧末端终止法06级生科A班苏狄 064120202摘要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。
关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。
虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。
然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。
DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。
双脱氧末端终止法测序一、原理双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。
其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。
通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。
Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。
ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。
因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。
这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP 的位置链延伸终止。
结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。
通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
双脱氧链终止法测序原理如图7-4-2所示。
,G or TPOOHPOOOHOHOHOOP1'αβγ,G or TPOOHPOOOHOHOHOOP1'αβγdNTPddNTP 图7-4-1 脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构5′GAGTCACACTTGAC—— 3′待测单链DNA3′CTG— 5′引物、Klenow酶、dA TP、dGTP、dCTP、dTTP和少量α-32P-dA TP图7-4-2 双脱氧链终止法测序原理二、Sanger 法DNA 测序的试剂（一）模板 有两种类型的DNA 模板可以作为Sanger 法测序的模板，即纯化的单链DNA 和经热变性或碱变性的双链DNA 。
1．单链DNA 模板：在一般情况下，可将靶DNA 片段克隆于M13mp 载体，从重组克隆M13mp 系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA 模板。
这种单链模板效果最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例，有经验的测序人员通过一次末端终止反应，能读取500个以上的核苷酸序列。
2．经热变性或碱变性的双链DNA 模板：尽管采用变性双链DNA 作测序模板显然简单且方便，但实际上很难获得单链模板那样的满意结果。
利用双链质粒模板测序，其中有两个至关重要的因素，即模板的质量和聚合酶的种类。
用小量制G A G T C A C A C T T 测序图谱识读5′3′加ddA TP 反应 3'ACTG — 5' 3'AACTG — 5' 3'AGTGTGAACTG — 5' 加ddCTP 反应 3'CAGTGTGAACTG — 5' 3'CTCAGTGTGAACTG — 5' 加ddTTP 反应3'TGAACTG — 5'3'TGTGAACTG — 5' 3'TCAGTGTGAACTG — 5'加ddGTP 反应3'GAACTG — 5' 3'GTGAACTG — 5' 3'GTGTGAACTG — 5'备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并不可取，高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。
其次是应采用高质量的聚合酶。
一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列。
应该注意的是，适合做双链模板的质粒，最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志，有配套的通用引物结合区。
最常用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。
双链模板测序最大的优势是对已知序列DNA的亚克隆进行鉴定，可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板过程。
（二）引物酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA 合成的引物。
在许多情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。
但也可以采用Sanger 法商定变性双链DNA模板的序列。
在以上两种情况下，都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。
适于M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15-29 个核苷酸，并可与紧靠M13mp18噬菌体多克隆位点区的HindⅢ位点成M13mp19 噬菌体多克隆位点区的EcoRI位点的序列互补。
这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行“双链”测序，并可从许多厂商中购置得到。
此外，还有若干家公司出售一些引物，这些引物下为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。
（三）DNA聚合酶如前所述，选用合适的DNA聚合酶进行测序反应也是保证测序质量的重要因素之一。
常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶：其中包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，如Mieredorf 和Prfeffer，1987）经过修饰消除了3'→5'外节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶（Sequenase）和测序酶 2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及从嗜热水生菌（T'hermus aquaticus）分离的耐热DNA聚合物（Taq DNA聚合酶）。
这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA序列的数量的质量。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow 片段：这种酶是最初用以建立Sanger 法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶。
通常碰到的两个问题是：1）Koenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP的掺入，而是因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。
由于该酶不能沿模板进行长中距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。
通常，这一反应只能得到大约250-350个核苷酸的序列。
如果分两步进行反应，所得序列的数目可以翻一番；其中第一步是初始标记步骤，采用低浓度的dNTP，而随后的第二步是链延伸－链终止反应，含有ddNTP和高浓度的dNTP （Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。
然而即使有了这些改进，用Klenow 酶所测序列的长度通常还是不如持续合成能力较强的测序酶。
2）这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。
将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题（Gomer和Firtel，1985)。
有时可采用一些dNTP类似物[如dITP或7－脱氮dGTP （7－deaza-dGTP）]来获取模板中可形成稳定二级结构的相应区段的序列信息，但Kleow酶对这些类似物的作用不如测序酶有效，这也许是因为它们使Klenow 酶原已较低的持续合成能力进一步降低。
总而言这，可以选用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段测定从引物5'位置起250个碱基以内的一段DNA序列，但不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。
（2）反转录酶：尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶解决一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。
来自禽类和鼠类反转录病毒的反转录酶在这一看来要比Klenow酶略胜一筹（Karanthaansis，1982;Graham等,1986 ）,尽管它们也许还是比测序酶逊色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。
（3）测序酶：测序酶（SequenaseTM）是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。
这酶原来具有很强的3'→5'外切核酸活性，经过修饰后，这一活性大部分均被消除。
测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，它完全缺失了3' →5'外切核酸酶活性，极其稳定而经活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。
测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7－脱氮－dGTP等用于提高分子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。
它是测定长段DNA序列的首选酶。
测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列。
实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。
为了充分利用测序酶极高的持续合成能力，可采用两步测序反应。
第一步首先采用低浓度的dNTP的较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP和较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP的有效掺入，这步反应的产物是仅仅延伸了20-30碱基的引物。