双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与

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sanger测序的原理和步骤

Sanger测序，也被称为双脱氧链终止法，是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。

以下是其原理和步骤：
原理：
Sanger测序基于DNA聚合酶的DNA合成过程，通过添加双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）来终止DNA链的延伸，从而得到一系列不同长度的DNA片段。

ddNTP与普通dNTP的区别在于其3′端缺少一个羟基，这使得ddNTP在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。

通过在反应中加入四种不同的ddNTP，可以得到包含不同长度的DNA片段，从而揭示出DNA分子中核苷酸的顺序。

步骤：
DNA模板制备：从待测序的DNA样品中提取出目标DNA片段，并进行PCR扩增，得到足够的DNA模板。

DNA合成反应：在PCR扩增反应中，加入四种不同的dNTP和一种ddNTP。

由于ddNTP可以随机地终止DNA链的延伸，因此可以得到一系列不同长度的DNA片段。

电泳分离：将得到的DNA片段进行电泳分离，使不同长度的DNA 片段得以分离。

检测：通过放射自显影等技术对电泳结果进行检测，从而确定DNA 序列。

双脱氧法测序的原理

双脱氧法测序的原理双脱氧法测序是一种常用的DNA测序技术，也是现代生物学和基因组学研究的重要工具之一。

本文将详细介绍双脱氧法测序的原理、步骤和应用。

一、双脱氧法测序的原理DNA序列是生物遗传信息的重要组成部分，而DNA测序就是确定DNA序列的过程。

双脱氧法测序是一种基于化学反应的DNA测序技术，其原理基于DNA的复制过程中的碱基互补特性和DNA聚合酶的活性。

DNA复制是生物体内的一个常见过程，其过程中DNA聚合酶通过读取DNA模板链的信息，将新的DNA链合成与模板链互补的链。

在DNA聚合过程中，DNA聚合酶会选择一种特定的核苷酸（dNTP）与DNA 模板链上的碱基进行互补配对，并将其加入到正在合成的新链中。

当DNA聚合酶遇到一个双脱氧核苷酸（ddNTP）时，它将无法进一步添加新的核苷酸，从而终止DNA链的合成。

双脱氧核苷酸是一种特殊的核苷酸，其分子结构与普通的核苷酸相似，但它缺少一个羟基（OH）基团。

这个羟基基团是DNA聚合酶在合成DNA链时所需要的，如果缺少了这个基团，DNA聚合酶就无法将新的核苷酸添加到DNA链中。

因此，当双脱氧核苷酸被加入到DNA合成反应中时，它会导致DNA链的终止，从而生成一系列不同长度的DNA片段。

利用这种原理，科学家可以将DNA模板链与DNA聚合酶和一定浓度的dNTP和ddNTP加入到反应体系中，然后通过一系列的化学反应，将DNA片段分离并进行测序。

具体来说，测序过程可以分为四个步骤：DNA片段的制备、DNA片段的分离、DNA片段的扩增和DNA片段的检测。

二、双脱氧法测序的步骤1. DNA片段的制备在双脱氧法测序中，需要制备一定长度的DNA片段，以便进行测序。

这些DNA片段可以通过多种方法获得，例如使用限制性内切酶或PCR扩增等技术。

一旦得到了合适的DNA片段，就可以将其与DNA聚合酶和dNTP和ddNTP一起加入到反应体系中。

2. DNA片段的分离在反应体系中，DNA片段会被随机地终止，并产生一系列不同长度的DNA片段。

掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。

由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。

本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。

实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。

每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。

但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。

例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。

将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。

其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。

由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。

故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。

[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。

(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。

2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。

双脱氧链端终止法

双脱氧链端终止法
双脱氧链端终止法（Double-dideoxy chain termination method），也称为Sanger法，是一种常用的DNA测序技术。

该方法通过使用带有特殊标记的二脱氧核苷酸（ddNTPs）来终止DNA合成过程，从而确定DNA序列。

在双脱氧链端终止法中，DNA片段作为模板，酶（如DNA聚合酶）和引物被加入到反应体系中。

该体系中还加入了四种常规的脱氧核苷酸（dNTPs），以及四种带有不同荧光标记的二脱氧核苷酸（ddNTPs）。

ddNTPs会在DNA合成过程中发生随机终止，从而产生不同长度的DNA片段，每个终止位置对应一种ddNTP。

反应混合物中的DNA片段随后被分离并利用凝胶电泳技术进行分析。

通过观察在不同波长下的荧光信号，可以确定每个ddNTP的终止位置，从而推断出DNA序列。

双脱氧链端终止法具有高度准确性和可靠性，广泛应用于DNA测序、基因组学研究、致病基因检测等领域。

该方法的原理和步骤相对简单，但是处理大规模样本时工作繁琐，且测序长度有限。

因此，在现代基因组学研究中，已有更先进的测序技术替代了双脱氧链端终止法，例如高通量测序技术（如Illumina 测序、Ion Torrent测序等）更快速、高效。

双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因序列拼接和分析PPT课件

1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析
教师：程琳 2011 年 11 月
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实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。
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2、具体操作：测序时分成四个反应, 每个反应除上
述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A 就终止了。
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双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件

双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从头合成子链
如果dNTP的3’碳上没有羟基
ddNTP——双脱氧核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加热入，引退物，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双脱氧鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双苷双苷双苷脱脱脱
氧氧氧胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸，一种二价金属离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电泳
95℃加热变性
冰上冷却
点样开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机原理相似，利用射线使胶片感光，然后通过显影过程把 “像”显示出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅读X射线片上的显影区带，即从测序引物的5’端读向 3'端。

双脱氧终止法的原理(一)

双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。

它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。

•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。

2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。

这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。

dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。

•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。

反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。

•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。

DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。

•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。

•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。

碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。

电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。

•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。

•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。

3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。

•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。

DNA sequence

�
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Dye terminator reactions
- the primer is not labeled with a dye - the dye is attached to the dideoxynucleotide, so whenever a ddNTP is added by the polymerase, the fragment is labeled according to the ddNTP at the end -since labeling occurs with the addition of the ddNTP, only one reaction per template is needed
3.测序反应的种类
① 引物标记法(Dye primer reactions)
② 终止物标记法(Dye terminator reactions)
Dye primer reactions
-fluorescent dye( label) on the primer, one specific dye for each nucleotide to be identified (A, C. G, T) -four separate reactions couple each specific primer with the corresponding ddNTP
序列测定第9章 DNA序列测定章序列
遗传与分子生物学系于杰 yujie19601117@
DNA 序列测定方法
1. Sanger 双脱氧链终止法 2. Maxam-Gilbert 化学修饰法
第一节 Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method)

阐述双脱氧法的原理

阐述双脱氧法的原理一、双脱氧法简介双脱氧法，也称为双脱氧指纹技术，是一种在DNA序列分析中用于确定DNA序列的技术。

该技术利用脱氧核苷酸中的特殊化学键，即2'-脱氧核糖上的羟基，将DNA序列中的每个碱基与特定的化学标记物连接，从而产生一种独特的指纹图谱。

通过分析这种指纹图谱，可以确定DNA序列中的碱基排列顺序。

二、双脱氧法的基本原理双脱氧法的原理基于链终止反应和荧光标记。

在DNA序列分析中，DNA 聚合酶在复制DNA时，遇到双脱氧核苷酸会停止复制，产生一个终止点。

通过在复制过程中依次加入不同种类的双脱氧核苷酸，可以控制终止点的位置，从而确定DNA序列中的碱基排列。

同时，利用荧光标记技术对每个碱基进行标记，可以更快速、准确地检测终止点的位置。

三、双脱氧法的操作流程1.准备样品：将待测DNA片段与引物混合，并进行高温变性处理，使DNA双链解开成单链。

2.聚合酶链反应（PCR）：在DNA聚合酶的作用下，根据引物扩增DNA 片段。

在每个扩增循环中，依次加入四种单核苷酸和双脱氧核苷酸。

3.终止反应：当聚合酶遇到双脱氧核苷酸时，会停止复制并产生一个终止点。

在每次加入双脱氧核苷酸后，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，使不同长度的DNA片段分离。

4.荧光标记：通过荧光标记技术对每个碱基进行标记，在电泳过程中可以检测到荧光信号。

根据荧光信号的位置和强度，确定DNA序列中的碱基排列顺序。

5.数据解析：通过计算机软件对数据进行解析，生成DNA序列图谱。

四、双脱氧法的应用场景双脱氧法广泛应用于生物医学领域，如基因组学、遗传学、分子生物学和法医学等。

在基因组学中，双脱氧法可用于基因组测序、基因突变检测和基因表达分析等研究；在遗传学中，双脱氧法可用于单核苷酸多态性（SNP）检测、突变筛查和基因组印记分析等；在分子生物学中，双脱氧法可用于DNA分子结构和功能的研究；在法医学中，双脱氧法可用于亲子鉴定、个体识别和法医病理学研究等。

双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影
5. 阅读测序结果
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA 单链DNA
加加热入，引退物火，
带引物的模板单链DNA
链延伸---终止反应
EDTA
核素标记的dNTP
双脱氧鸟苷
分成四管双双脱脱氧氧腺胸苷苷
双脱氧胞苷
乙二胺四乙酸，一种二价金属离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 5℃加热变性
冰上冷却点样开始电泳
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
Frederick Sanger
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从头合成子链
如果dNTP的3’碳上没有羟基 ddNTP——双脱氧核苷酸
基本原理：
DNA复制
ddNTP的结构
聚丙烯酰胺凝胶电泳
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶底物：dNTP
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
放射自显影
固定凝胶真空抽干放入 X射线片夹
与照相机原理相似，利用射线使胶片感光，然后通过显影过程把 “像”显示出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
阅读测序结果
一般是从下往上阅读X射线片上的显影区带，即从测序引物的5’端读向 3'端。
模板：单链DNA 引物：需要
引物的作用：提供3’羟基末端

核酸的核苷酸序列测定方法

核酸的核苷酸序列测定方法一、Sanger双脱氧链终止法1、基本原理：将2'3'-双脱氧核苷酸（ddNTP）掺入到新合成的DNA链中，由于ddNTP缺乏3'-OH，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应终止。

2、基本步骤：进行四组平行反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。

这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA 的核苷酸序列。

【例如】：某一个DNA分子, 互补序列是GATCCGAT:①在第一个反应体系中加入dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA,②在第二个反应体系中加入dNTP+ddCTP,产生的都是以C结尾的片段:GATC, GATCC,③在第三个反应体系中加入dNTP+ddGTP,产生的都是以G结尾的片段:G, GATCCG④在第四个反应体系中加入dNTP+ddTTP,产生的都是以T结尾的片段:GAT, GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列, ①反应体系中的片段长度为2, 7; ②反应体系中的为4, 5;③反应体系中为1, 6; ④反应体系中的为3, 8, 四个反应体系的产物分别电泳, 结果为：87654321 。

双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分析

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主要的blast程序
程序名 Blastn Blastp
查询序列核酸
蛋白质
Blastx
核酸
Tblastn 蛋白质
TBlastx 核酸
数据库核酸
蛋白质蛋白质
核酸核酸
搜索方法
核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
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荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。
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Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：手工测序：最大约300 bp；自动测序：最大约1200 bp。
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同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了.
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假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.
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2、具体操作：测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外

DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法

DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。

其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。

DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。

通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。

ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。

在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。

在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。

通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。

二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。

1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。

简述sanger双脱氧链终止法测序的基本原理

简述sanger双脱氧链终止法测序的基本原理
Sanger双脱氧链终止法测序是一种常见的DNA测序方法，基本原理如下：
1. 质粒扩增：将待测序列插入质粒中，用细菌进行扩增。

2. DNA片段制备：将DNA分离出来，并使用限制性内切酶将其切成短片段。

3. 测序反应：在测序反应液中，加入片段的一端富含A、T、C、
G四种核苷酸的引物和DNA聚合酶，进行DNA合成反应。

4. 单脱氧末端：加入一种叫做二氧化硫的化学物质，它会使得DNA合成酶在引物加上核苷酸之后停止合成，同时留下一个单脱氧末端。

5. 终止反应：在反应中加入一种单个碱基的二氧化碳（ddNTP），并让其与DNA聚合酶结合，使得DNA合成停在单脱氧末端处，形成一
些具有不同长度的DNA片段。

6. 电泳分离：使用聚丙烯酰胺凝胶的电泳进行分离，不同长度
的DNA片段会呈现不同的移动速度。

7. 读取结果：根据DNA片段长度从短到长的顺序读取每个片段
中脱氧核苷酸的序列，最终得到完整的DNA序列。

Sanger双脱氧链终止法测序具有准确性高、数据可靠等优点，在基因测序、基因编辑等领域被广泛应用。

Sanger测序原理与方法

Sanger测序原理与方法在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。

快速DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

测序原理利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。

每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，终止点由反应中相应的双脱氧而定。

测序方法基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR 产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。

由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。

分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

测序设备DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)，性能特点，自动化程度高，提供连续、无需监控的操作，自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析，可连续运行24小时无需人工干预。

双脱氧链终止法测序原理

双脱氧链终止法测序原理双脱氧链终止法（Sanger测序法）是目前应用最广泛的测序方法之一。

它可以用来确定DNA序列，并已经被广泛应用于基因组学、表观基因组学和功能基因组学等领域。

那么双脱氧链终止法是如何进行的呢？下面我们来一步步了解其原理。

1. PCR扩增首先，需要对DNA样本进行PCR扩增，以增加样本的数量和扩大目标片段。

PCR（聚合酶链式反应）是一种可重复的、高效和快速的DNA增殖技术，能够在较短时间内扩增原始DNA样本中的目标序列。

假设我们要测序的目标序列是A-T-G-C-A，而实际的DNA样本中存在许多相同的序列，我们可以使用引物（即PCR扩增时所用的引物）扩增该目标序列。

2. 序列扩展在进行双脱氧链终止法测序之前，需要将PCR扩增得到的DNA片段进行序列扩展。

这一步需要的是一种特殊的核苷酸（ddNTP）。

3. 反应结束在DNA合成的反应体系中，4种核苷酸（即A、T、G、C）与特殊的核苷酸ddNTP一同参与反应，这种反应会随着稀释后降低ddNTP含量的时间而结束。

当ddNTP和其他核苷酸竞争使用反应体系中的酶时，实际上是随机地在生成DNA链的位置上停止DNA链的生长。

这导致了各种长度的DNA链的产生。

4. 每种链被标识在每种ddNTP结束DNA生长时，将生成各种长度的DNA链，并用荧光染料标记在每个ddNTP上。

之后，可以将不同长度的DNA库通过凝胶电泳分开，并使用激光扫描器检测有荧光的质点。

5. 生成DNA序列根据单个荧光点的顺序和顺序位置，可以逆推出整个DNA序列。

这个过程需要高度的计算能力，高速计算机能够对生成的所有数据进行统计和分析，并推断出序列。

总的来说，双脱氧链终止法测序原理是一种将PCR扩增、序列扩展、反应结束、标识、分析等多个步骤进行紧密配合的复杂化学、生物信息学方法。

Sanger双脱氧链终止法原理

Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA 的核苷酸序列。

双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger 等1977年提出。

其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分四个泳道进行电泳。

以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA 复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。

当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。

ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。