试验三琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
DNA的上样正确的DNA上样量是条带清晰的保证。
注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量弱甚至缺失。
TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。
Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
Marker应该选择在目标片段大小附近ladderTIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。
需要注意的是Marker 的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。
如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。
从而防止HindIII或EcoRI酶切造成凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶〔EB〕，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。
而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。
TIANGEN公司的GeneGreen相比那么是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。
注意观察凝胶时应根据染料不同使用适宜的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带那么不易观察，出现条带模糊的现象。
实例实验：一、实验原理用于DNA别离，纯化和鉴定的凝胶电泳有二类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于1kb和大于1kb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用小于1kb的DNA。
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便，快速别离、纯化和鉴定DNADNA在琼脂糖凝胶中迁移率和凝胶浓度、DNA 分子大小、DNAEB〕，EB在紫外钱照射下的发射荧光。
EB能插入DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍。
荧光的强度正比于DNA的含量，如将浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。
二、试剂：1．电泳缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L NaAC2mmol/L EDTA50倍电泳缓冲液，用时取5ml，重蒸水稀释至250ml。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。
除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。
（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。
与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。
进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。
SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。
（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
实验三__DNA的琼脂糖凝胶电泳1
1
2
3
4
5
6
四 实验结果
4 泳道 maker
1 泳道 质粒DNA
2、3、5、6泳道 酶切产物
质粒
酶切 片段
五 注意事项
EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!!!
六习 题
1. 琼脂糖凝胶电泳的适用范围？
2. 2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？
10
标准 DNA/E Co130I
13929
50 000~1 000
20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
5
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间
DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌 入染料的存在、电泳缓冲液的组成。
6
EB(溴化乙锭) 能插入DNA分子碱基对之间，导 致 EB 与 DNA 结合。 DNA 吸收的 260nm 的紫外光 传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的 射线，均可在可见光区以 590波长发射出来，呈橙
在紫外线的照射下结合溴化
乙锭的DNA分子发出荧光
红色。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1μ g.
EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下1520min ；不会使核酸断裂；灵敏度高， 10ng或更 少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要 经过处理才能丢弃。
7743 6223 3472 2690 1882
酶切片段
4ul
2ul
11
上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的
速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电 泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子
质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定
实验题目质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定实验目的掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作实验原理质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。
对数期大肠埃希菌含有质粒。
溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。
离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。
琼脂糖凝胶电泳蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。
此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA 在凝胶中的位置。
实验主要步骤质粒DNA提取1.取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液2.加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液3.加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上4.加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min5.离心管以12000r/min离心5min6.取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min7.取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥8.用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min9.用50ul无菌水溶解质粒DNA琼脂糖凝胶电泳：1.制胶。
将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度与质量
23
实验二 质粒DNA的提取
【实验目的与意义】
质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技 术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法。
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒 DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。
2019/12/13
LB固体培养基的配方如下：
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl
10g
琼脂 15～20g
水 1000mL
pH 7.0
2019/12/13
三峡大学李晓玲编写与制作
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【试剂】
酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂； mol/L NaOH， 1mol/L HCl； 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器， 天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.5～ 9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下 面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通 常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质 量和气温的不同而有所不同。
2019/12/13
三峡大学李晓玲编写与制作
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LB培养基
由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀 碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖
实 验 内 容
实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌 实验二 质粒DNA的提取 实验三 琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验五 DNA重组（连接反应） 实验六 植物DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 实验七 PCR基因扩增
质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告
实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。
2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。
3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。
2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。
在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。
2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。
4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。
5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。
一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一目的学习质粒的酶切及电泳分析。
二原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三试剂与主要仪器（一）试剂1．Eco RⅠ酶2．λ DNA3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5．溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6．琼脂糖（二）仪器1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱四操作步骤（一）质粒DNA酶切1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
管号①②③质粒DNA 10 10 10Eco RⅠ/ μl 1 1酶切Buffer（10×）/ μl 2 2 2ddH2O/ μl8 7 6RNA酶 1 2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。
然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
（二）琼脂糖凝胶电泳1 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。
冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
（1）琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15 年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner 发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。
凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
通贯凝胶的电场接通后，在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移。
（3）琼脂糖凝胶的染色
电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB 的染液中，染色10 分钟，取出紫外灯下观察。
原文地址:/biotech/exp/molbio/DNA/2010/k820116114.html。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
三、仪器、材料与试剂
微波炉 琼脂糖凝胶电泳系统 紫外线投射仪 质粒DNA DNA DNA marker 50×TAE 6×凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1％溴化乙锭溶液
溶解琼脂糖 分离质粒DNA片段 检测质粒DNA片段 电泳样品 DNA相对分子质量标准物 电泳缓冲液 沉淀DNA并起指示作用 电泳支持介质 嵌入DNA中，在紫外灯下 显色
五、思考题
EB的中文名称是什么？使用EB时应注意些什么？ 怎么制备一块20mL体积1％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭 溶液终浓度0.5µg/mL）？ 什么是Loading Buffer？Loading Buffer中含有哪些成 分？各组分的作用是什么？
？
质粒DNA分子有三种构型，即CCCDNA、 OCDNA和LDNA，这三种构型的质粒 DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因 此电泳后呈三条带，CCCDNA泳动最快， 其次是LDNA，最慢的是OCDNA EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子 中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB 分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电 泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检 测。可以检测10ng 的DNA 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注 意安全，必须戴塑料或乳胶手套
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔， 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极 泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双 链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正 极方向移动 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应， 即DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可 以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE 和TPE三种缓冲体系
琼脂糖凝胶电泳试验课件
PAG
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0
不同（空间） 不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间 进行缓冲液循环，并经常更新TAE。
缓冲液的离子强度 离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般 离子强度 在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导 电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。 缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样 值 品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带 负电荷，向正极泳动。 在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环 DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温 度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
2）凝胶孔径大小 ）
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电 泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的 分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。
凝胶
琼脂糖
胶浓度（ ） 线状DNA分子的有效分 胶浓度（%） 线状 分子的有效分 离范围
三、实验原理
概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向
正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异， 对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳 时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射 下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右 的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约 200bp~50kb。
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
袱演芒厌弱磨箍溃蚁乙芹挝鸵亥圣龚引帐哪屹哺桔指致艳怕甭宰毫扎戊爸质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
（3）胶浓度 （4）电场强度：根据需要选择合适电压。 为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm， 但分辨率不高。 精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。 （5）溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂。
5、 DNA电泳的标准分子量（DNA Marker） 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。
室减减态夫载凹拆滚狼枢挠钎育酷支防趾兢让郊匈腰惺刘望垛件伴几变托质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
毛初市薪负龄硼吗植篡畸泪财础炬甩叭巍嫡锅旷恼疙戚煎八剧卵伺压快胀质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
3.0
500bp~1kb
500bp~1kb
4.0
100bp~500bp
6.0
10bp～100bp
抑殷上共缴袄鹃洱弥晾明柞稠硫雇淤剃柯溯山线经堰滨俩桅无国砌享裁竹质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
2、DNA电泳影响因素 主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。 （1）DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢， 迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 （2）DNA分子构型 相同分子量质粒DNA，构型不同电泳时受的阻力不同，泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状次之，开环最慢。
质粒DNA测定-实验报告
实验名称实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：；数字、英文用Times New Roman；标题用：黑体，加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反响)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外〔缓冲液中〕复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反响步骤为：A.变性：加热反响系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温〔35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右〕，与模板DNA互补退火形成局部双链。
C.延伸：溶液反响温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复2.质粒DNA的提取与制备(1)碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2)离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯洁质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析〔紫外分光光度法〕：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反响DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯洁A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质〔芳香族〕或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验三 琼脂糖凝胶电泳
三、实验材料
上次实验提取的质粒 pSK（3 kb） 和MP3 （6 kb）
关于质粒大小在电泳中的鉴定：酶切后线性化条带电泳时 所处的位置指示质粒的大小。
该质粒载体用的是pUC的复制子，拷 贝数能达到500-700个。
（三）电泳
打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动， 约一小时后即可观察。
（四）观察
将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯， 可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA
的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初
TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存； TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储
存，易产生沉淀；
分离大片段最好用TAE，小片段用TBE； TBE存在硼离子，会对一些酶的活性稍有影响。
常用6×凝胶加样缓冲液配方
有的10 × loading buffer中多了一样SDS（1%），它会使酶类（如Taq酶和限 制性内切酶）变性，有终止酶促反应的作用。但在电泳时（以PCR产物为 例），在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一 条带没有什么区别（大概1000 bp左右）。不加SDS的凝胶加样缓冲液只有 电泳指示剂和沉淀样品的作用。
注意：同样的marker点在不同的胶孔中，电泳迁移率有差异。因为电泳 时有边缘效应，边上的跑得快；跑胶时间长了会发热，整快胶受热不均 时也会出现这种现象。
碱裂解法抽提质粒电泳会出现几条带？
但因为抽提质粒时各人的操作差异,造成CCC/OC/L等多种构型， 条带多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三条：超螺旋、 开环和复制中间体。 如果RNaseA添加过少或者质量不高，会导致RNA降解不完全， 会有一条远离点样孔跑的最快的残余RNA条带；根据RNA降解 程度不同，条带亮度会有很大差异。 提取过程中加溶液震荡剧烈会导致基因组片段断裂成很小的 片段，因此质粒中含有基因组的短片段会导致一些电泳条带 的出现。 还有电泳时间的长短造成各条带的移动距离也不一，一般较 难判断是对是错。电泳跑的时间较短，尽管能分出大小，但 习惯上跑开点对分辨差别不大的条带有好处，短胶容易出现 误判。
质粒DNA的小量提取DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的或核区原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为）中，乃至于植物的等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler()等以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而继续复制，可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。
琼脂糖凝胶电泳检测质粒dna的原理
琼脂糖凝胶电泳检测质粒dna的原理
1.凝胶的制备：首先，需要制备琼脂糖凝胶。
琼脂糖是一种复合多糖，可以形成凝胶状的基质，用于分离DNA分子。
通常使用琼脂糖粉末加热溶
解在缓冲液中，然后在模具中凝固，形成凝胶板。
2.凝胶孔径选择：根据分析的DNA分子大小范围，选择凝胶孔径。
较
大的孔径适合分离较大的DNA片段，而较小的孔径适合分离较小的DNA片段。
3.样品预处理：将待检测的质粒DNA样品与DNA加载缓冲液混合，加
热处理使DNA样品变为单链结构，并添加胶载剂，以增加样品在凝胶中的
密度。
4.样品加载：将预处理的样品加载到凝胶的孔中。
通过电极引导，电
场会使DNA从阴极向阳极迁移。
5.电场应用：在凝胶板上施加电场，电场的方向是从阴极向阳极。
DNA负电荷使其朝阳极方向移动，在凝胶中形成DNA迁移带。
6.可视化：当DNA迁移到凝胶中一定距离时，可以通过染色剂（如溴
化乙锭）进一步可视化DNA条带。
溴化乙锭在UV光下发出荧光，使DNA
条带可看见。
7.电泳时间控制：电泳时间是控制DNA迁移的重要参数。
较长电泳时
间可以让DNA片段分离得更好，但也可能导致DNA过度迁移。
8.分析和测量：根据DNA迁移的距离和标准DNA片段的迁移距离，可
以确定每个条带对应的DNA片段大小。
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③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千 万不要将吸嘴直接插到液体底部； ④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入 吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； ⑤等一秒钟后将吸嘴提离液面 ⑥排出液体时，平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压 至第二停点以排出剩余液体； ⑦提起微量移液器，将吸嘴在容器壁擦过； ⑧然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
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3. 微量移液器的使用
移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移 液器能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同 时关系到移液器的使用寿命。
移液器由可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的 移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量 有2.5ul，10ul, 20ul, 200ul, 1ml，5ml等规格。
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③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再 以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋 松紧一致，避免漏气。
④ 用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内 的空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内 的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到 所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实 验用0.11MPa,1
NaCl
10g/L
琼脂 15g/L
蒸馏水定容至 1000mL，调pH 7.4。
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【试剂】
酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂； 1mol/L NaOH， 1mol/L HCl； 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分 装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸 （pH 5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳， 纱布等。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完 全排尽，才能关上排气阀，维持所需压力。
⑤ 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降， 当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打 开盖子，取出灭菌物品。
！！压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否
则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压 力不平衡而冲出瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚 至灼伤使用者。
浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂
在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基
中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
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LB培养基配方
由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用 稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性。
LB固体培养基的配方如下：
胰蛋白胨 10g/L
实 实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌 实验二 质粒DNA的提取
验 实验三 琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA 内 实验四 DNA限制性内切酶酶切及电泳分析 容 实验五 DNA片段的PCR扩增
实验六 PCR产物电泳检测及切胶回收
实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验八 植物基因组DNA提取
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实验一 实验准备及培养基制备与灭菌
【实验目的】
主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅 的使用及实验操作注意事项
【实验准备内容】
1.实验准备： 器皿清洗、培养基配制、分装灭菌、取用保存 2. 离心机的使用 ①打开离心机电源开关，进入待机状态。 ②选择合适的转头 ③离心管平衡误差应在0.1克以内。 ④选择离心参数：
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⑤将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。 ⑥按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。 ⑦按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）
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【实验原理】
LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基， 它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为 微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源， 而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定 量琼脂作凝固剂。
琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水
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移液器的使用
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量液操作注意事项
a. 连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最 大或最小量程；
b. 在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置， 平时不用时置移液器于架上；
c. 吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液 器的上部；
d. 在吸取不同的液体时，要切记更换吸头；
e. 移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。
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⑥灭菌打湿的包装可置于70℃温箱中烘干备用。也可将取 出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂 菌生长，即可待用。 5.分组：4-5人一大组，一个实验桌1套移液枪 6.实验器材准备：
每组蓝枪头和黄枪头各1盒，全班另加2包，1.5ml的离 心管1盒或1包，30ml离心管12个，培养皿10个。全班配制 LB固体和液体培养基各1000ml，分装成200ml每份。
应等离心速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机 有异常（如不平衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应 立即按STOP键，必要时直接按电源开关切断电源，停止继 续离心，并找出原因。 ⑧机器如发现故障，请及时与有关人员联系。 ⑨使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利 于湿气蒸发。
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离心管在转子中的摆放位置
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4. 高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项
①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水 面与三角搁架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不 可过少，以防灭菌锅烧干而损坏加热棒或引起炸裂事故。
②放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤， 以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端 均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉 塞。
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【思考题】
1. 高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气 排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到 “0”时才能打开排气阀，开盖取物？
2. 移液操作应注意哪些事项？
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【LB培养基的制备及灭菌】
【实验目的】 通过对LB培养基的配制，掌握配制培养 基的一般方法和步骤。