定量PCR分析的相对定量法.

定量PCR分析的相对定量法

预先研读科研文献，提出问题。拟用60Co-γ射线照射HeLa细胞，经0，2，4，8，10Gy不同吸收剂量照射4小时后，研究60Co-γ射线对GRP78 mRNA表达水平的剂量影响关系。

设计拟扩增GRP78以及GAPDH（内参基因）引物序列，稀释合成后引物，验证是否合格能用，储存备用。上下引物可以考虑预混，储存备用。

准备总RNA提取试剂盒，熟悉实验方法，即熟悉基本步骤与相应所用耗材，准备所用耗材。知道经该试剂盒方法提取后实际剩下的总RNA体积数。

先培养二瓶细胞，长满后消化后混合，细胞计数，分成6瓶细胞，接种培养至第二天早晨。编号。送去钴源室60Co-γ射线照射，无菌操作，放回培养4小时。

按试剂盒程序提取各瓶细胞总RNA。编号，测定并记录各管总RNA含量与体积数。当天反转录成cDNA，并编号，测定总cDNA含量与体积数。预约定量PCR仪器使用时间。

做5X6X2=60份定量PCR反应计划，因有5个剂量组，每一个剂量组做6次平行，2个基因。考虑额外需要，故预混试剂拟按70份反应计划去准备。做好96孔板中各孔排布图。

配制除样品cDNA和引物外的预混液，按计划加入96孔板中各孔指定位置内。再有规律地依次加入规定量的cDNA样品，然后在排布图指定孔位置中加入指定量和指定种类的引物。核实或做好加样记录。

定量PCR仪器分析开机预热、设定定量PCR仪器基本参数、位置参数和循环参数等；再次混匀96孔板中样品，将样品96孔板放入仪器中，检查后运行PCR仪器。

设计原始资料表格样式，记录各组实际扩增后所得CT值。

根据前面介绍的绝对定量法得到的标准曲线如下图，结合上表查找相应的基因含量数，转录如下表中，然后计算相应的平均数与标准差。

根据均值二次校对值和校对SD用SPSS软件做结果的ANOV A统计分析，检验各组之间的差异有无统计学意义，然后用excel软件作柱状图，并在柱状图上标示出SD变化，以及有无统计显著性差异的标识。

将该excel柱状图结果转换成PPT结论图，并给出图题、图例、实验方法主要内容以及注释。转换成JPG文件，交给老师。