制药用水微生物限度检验方法学确认2015.11

制药用水-微生物限度检验方法学确认

目录

一、引言

1、概述

2、验证的目的

二、验证方法合格标准

三、主要材料确认

1、仪器设备确认

2、辅助材料确认

3、人员确认

4、商品培养基及灭菌培养基确认

5、菌种及菌液的制备

四、样品制备

1、稀释液

2、供试液制备

3、操作方法

五、方法验证

1、需氧菌总数的计数方法验证

2、计算菌回收率公式

六、验证结果及评价

七、再验证周期

八、验证结论批准

一、引言

1、概述：

根据《中国药典》2015年版三部通则“1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（以下简称《药典》）的要求，对内控标准中有“微生物限度”检查项的产品进行该项验证。根据《中国药典》2015年版三部纯化水进行方法学确认。

2、验证目的：

确保药品微生物限度检查实验的准确性，在建立药品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌总数计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该样品的需氧菌总数的测定。

二、验证方法合格标准

1.前提条件：培养基适用性实验应符合规定，即：被检R2A培养基上菌落平均数与对照培养基上菌落平均数比值应为0.5~2，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

2.计数方法适用性试验：在3次独立的平行试验中，若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组的平均菌落数的比值）均在0.5～2范围内，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的需氧菌总数。

三、主要材料确认

1、仪器、设备确认

检查结果：

检查人：复核人：日期：

2、辅助材料确认

2.1移液器、接种环、酒精灯、记号笔、酒精棉球、试管架、试管、玻璃平皿、止血钳等2.2需灭菌物品见《微生物限度检查法验证记录》

2.3一次性无菌用具见下表

检查结果：

检查人：复核人：日期：

3、人员确认

化验员经设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，考核合格后上岗。

4、商品培养基及灭菌培养基

4.1 所用培养基均不得有结块、吸潮、异味、颜色发生改变等现象。

培养基检查结果，如下

检查结果：

检查人：复核人：日期：

4.2已灭菌培养基的检查结果及结论见《微生物限度检查法验证记录》。

5、菌种及菌液的制备

5.1菌种来源：黑龙江省药检所、公司收集的制药用水系统中的菌落。

菌种确认

5.2菌液的制备

分取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、水系统环境菌（冻干三）、水系统环境菌（冻干二）、水系统环境菌（固体车间）的新鲜培养物少许接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上（环境菌应预先用胰酪大豆胨琼脂培养基平板增菌），30~35℃培养18~24小时；上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

菌悬液制备后在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2~8℃可在24h内使用。5.2.1阴性对照：菌液制备时应进行2个平板或试管的阴性对照试验，以确认菌种制备有效。

5.3菌液菌落数：详见《微生物限度检查法验证记录》

四、样品制备

1稀释液：氯化钠-蛋白胨缓冲液。

2供试液制备：薄膜过滤法

取本品1ml加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀。

3操作方法：取上述供试液100ml，按薄膜过滤法过滤，滤完后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。需氧菌总数计数平板倒置于30~35℃培养箱培养5天。

五、方法验证

1.培养基适用性试验及有效期考察

1.1 R2A琼脂培养基制备基础方法：取18.124g，加水1000ml，微温溶解后，装入4个250ml

三角瓶。使用量较大时，按照验证的装载方式及灭菌程序，在其限定内调整单次灭菌量。可能的装载方式：80L灭菌锅250ml*10瓶*3层或者500ml*7瓶*3层

100L灭菌锅250ml*22瓶*2层或者500ml*15瓶*2层

灭菌条件为：121℃、0.1MPa，15min。

含第7日、14日、21日的有效期考察，每次适用性试验需要使用600ml；共需3次。1.1.1对照培养基的制备：取对照培养基一袋，加水300ml，微温溶解，装入相同容积三角瓶

中，与被检培养基相同条件同时灭菌。

1.2接种上述5种菌株至待测R2A琼脂培养基平板（每个平板中含培养基15~20ml），每个

菌株平行制备2个平板；同样方法接种上述菌株至对照培养基。

培养温度30~35℃，时间不超过3天。

被检培养基上每种菌株的平均菌落数与对照培养基上的平均菌落数比值应在0.5~2，且菌落形态大小与对照培养基一致。

1.3在第7日、14日和21日按1.2方法使用1.1配制的R2A琼脂培养基，及新制备的对照

培养基进行培养基适用性检查。

稳定性及有效期考察表

结论：

评价人：评价日期：

2需氧菌总数的计数方法验证

2.1设置试验组、菌液对照组、供试品对照组，分别取三个不同日期的供试品（选择储罐取

样点）进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。试验菌液为铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌。

（1）试验组取上述供试液100ml，分别加入含菌数不大于100cfu/ml的试验菌液1ml，按薄膜过滤法过滤。过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培