课件1-基因检测新进展

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2.3.3 三代测序 单分子测序技术
❖ 单分子即时DNA测序技术(SMRT) ❖ HeliScope单分子测序 ❖ 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序 ❖ 纳米孔单分子测序技术 ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ 速度更快 片段更长 精度更高 可直接测RNA序列。 可直接测甲基化的DNA序列。
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一至三代测序技术比较
第二个循环 经历25-30个循环 目的DNA增加106~7
PCR 的基本反应步骤
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2.3 基因测序
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2.3.1 一代测序 （Sanger测序，双脱氧链终止法）
Sanger法的原理是：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，
以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系
中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测 序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短
2002年，欧盟有超过70 万人进行了基因检测实验
1990s
2000s
2010s
1994年，美国率先在一些 人群中开展肠癌基因筛检
2004年，世界卫生组织推 出基因检测国际标准
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基因检测风靡全球
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第2部分 基因检测的技术方法
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基因检测的技术方法
基因异常的形式有很多种，所适用的检测方法 也有很多种 不同的检测方法相互弥补，难以完全替代
PDGFRmRNA表达 肾细胞癌 VEGFR1/2mRNA 表达 VEGFmRNA表达 结直肠癌 VEGFR1/2mRNA 表达 HER2基因扩增 乳腺癌 PI3KCA基因突 变
PDGFR
索拉菲尼 舒尼替尼
高表达患者能明显提高生存率
VEGFR1/2
高表达患者能明显提高生存率
VEGF 贝伐单抗 VEGFR1/2
根据检查目的，选择合适的检测方法很重要
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基因检测的技术方法
杂交 扩增 测序
Southern杂交 Northern杂交 荧光原位杂交 基因芯片 …………
逆转录PCR 反向PCR 巢式PCR 原位PCR 多重等位基因PCR 不对称PCR 锚定PCR
一代测序（Sanger测序法） 二代测序（NGS） 三代测序（NNGS） …………
由CYP2C19代谢的临床代表性药物
氯吡格雷
氯吡格雷（波立维）是目前世界范围内使用最广泛的抗血小板药，可
以减少心血管疾病患者心脏病发作、卒中以及死亡的风险。 氯吡格雷是一种前体药物，在体外无活性，必须经CYP2C19代谢活
化才能抑制血小板的聚集。
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CYP2C19基因检测指导氯吡格雷 个体化用药
基因检测新进展
郑州大学第一附属医院 河南省卫生厅临床检验中心 明 亮
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目 录
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基因与基因检测 基因检测的技术方法 基因检测的应用进展
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2
第1部分 基因与基因检测
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什么是基因？
基因是编码RNA和蛋白质的核苷酸序列；大部分
生物中构成基因的核酸物质是DNA，少数生物ຫໍສະໝຸດ Baidu
（如RNA病毒）中是RNA。 地球上人与人之间基因序列的差异仅仅为万分之 一，其中99.99%序列是相同的。
-------精准医疗离不开精准检测
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《我的医疗选择》——安吉丽娜·朱莉致纽约时报
时间：2013年5月14日
内容：
我是BRCA1基因携带者，这 种基因存在着缺陷，会导致 罹患乳腺癌和卵巢癌的风险 大幅提高。 ……做出接受乳房切除手术 这一决定并非易事。然而， 我很高兴自己做出了这样的 决定。现在，我的乳腺癌发 病率已经从87%降至5%以 下……
不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，
放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列， 由此推知待测模板链的序列 。
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2.3.2 二代测序 next—generation sequencing
第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、 Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的 SOLiD测序平台。 第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万 条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度 测序变得方便易行。
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“一巴掌致聋基因”SLC26A4
临床 表现
迟发性耳聋 大前庭水管综合征
遗传 常染色体隐性遗传 方式 携带 14.5%的聋人 比率 约2%正常人群携带
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“一针致聋”基因12SrRNA
临床 药物敏感性耳聋 表现 遗传 方式 线粒体基因 母系遗传
携带 4.4%的聋人 比率 0.3%正常人群
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后天高频聋基因GJB3
细菌感染 病毒感染 耳毒性药物 外伤磕碰 声损伤 ……
很可能是 遗传因素
Journal of Audiology and Speech Pathology. 2011,19(1):73-77
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第一大耳聋基因GJB2
临床 先天性耳聋 表现 遗传 常染色体隐性遗传 方式 携带 聋人中的21% 比率 正常人群的2%~3%

基 因 检 测 分 型
CYP2C19 *1/*1 快代谢者
常规用药

CYP2C19 *1/*2 * 1/*3 中等代谢者
增加用药量或者换药
CYP2C19 *2/*2 *2/*3 *3/*3 弱代谢者
增加用药量或者换药
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什么是基因检测？
基因检测是通过血液、体 液或细胞对 DNA 分子信 息作检测，预知身体患 疾病的风险，分析基因
情况。基因检测可以诊
断疾病，也可以用于疾 病风险的预测。
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基因检测的发展历史
2015年，奥巴马人类基因组 计划所取得的成果，并宣布 了新的项目精准医疗
1990年，人类基因 组计划正式启动
长片段PCR
荧光定量PCR …………
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2.1 荧光原位杂交（FISH）
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补
的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的 杂交双链核酸。
广泛应用于基因组结构研究、
BCR ABL
染色体精细结构变异分析、病
毒感染分析、人类产前诊断、 肿瘤遗传学和基因组进化研究
1、野生型疗效差 2、突变型疗效显著增加 3、Exon20中790密码子发生突变，可 能出现继发性耐药
1、野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低 1、野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低 1、野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低 1、野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低 1、野生型疗效差 2、突变型疗效显著增加 3、Exon11突变有效率最高 1、野生型疗效差 2、突变型疗效显著增加 3 、 Exon18 中 D842V 突变可能出现原 发性耐药 24
BCR/ABL
待许多领域。
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2.2 聚合酶链式反应（PCR）
普通PCR检测技术
实时荧光定量PCR检测技术 (外标法）
高敏感度内标荧光定量PCR 检测技术（内标法）
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聚合酶链式反应（PCR）的原理
以DNA一条链为模板
聚合酶 引物
以半保留复制原则合成新的DNA
模板DNA
94℃变性 55℃退火 72℃引物延伸
朱莉效应
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精准医疗概念
精准医疗是应用现代遗传技术，分子影像技术，生 物信息技术结合患者生活环境和临床数据实现精准 的治疗与诊断，制定具有个性化的疾病预防和治疗 方案。是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技
术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用
而发展起来的新型医学概念与医疗模式 中国工程院院士詹启敏
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第3部分 基因检测的应用进展
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3.1 肿瘤靶向治疗
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靶向治疗的进展
基因检测
方案1
方案2
方案3
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肿瘤靶向药物（部分）
疾病 相关靶标基因 相关基因位点 药物名称 指导意义 EGFR基因突变 非小细胞肺癌 KRAS基因突变 12、13、61密码子 12、13、61密码子 466、600、616密码子 18、19、20、21 外显子 吉非替尼 （易瑞沙） 埃罗替尼
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HPV基因分型与相关疾病
扁平疣 寻常疣 3、10、27、28、41
1、2、4、7、27、29、40、54 5、8、12、14、15、17、19、25 38、46、47、49、 疣状表皮发育不良 50 6、11、16、18、31、33、34、35、39、51、64尖锐湿疣 68、70、73 鲍温样丘疹病 宫颈上皮内瘤 浸润性宫颈癌 阴茎癌 16、18、39、42 6、11、16、18、31、33、35、43、44、51、56、 58、61 16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、 59、68 16、18
慢性粒细胞白血病
ABL突变
315密码子
格列卫
慢性粒细胞白血病患者中， ABL 基因野生型患者疗效较好； T315I 突变型患者，疗效显著降低
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3.2 精准医疗计划
2015年奥巴马提出精准医疗
计划：精准医学赋予了我们
一个实现全新医学突破的伟 大机会，拯救生命的发现将
迎来新时代，而这一项目将
为此奠定基础。
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DNA的分子结构
碱基 磷酸
脱氧核糖
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基因的发现历程
1928年 1929年 1952年 1953年 1961年 1970年
格里菲斯证明遗传物 质是核酸 科赛尔和琼斯以及列文发现核酸由 核苷酸组成，核苷酸由碱基、核糖 和磷酸构成。 赫尔希证明DNA具有遗传功能 沃森和克里克提出DNA的双螺旋 结构和自我复制机制 马太和尼伦伯格破解出Phe的密 码子（UUU） 克里克提出完整的中心法则模式
GJB3：我国克隆的第一个遗传病基因 后天高频听力损失 需要进行听力补偿
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3.3.3 药物代谢基因检测
• 药物代谢受药物代谢酶调控，药物代谢酶受基因调控。
• 根据药物代谢基因的突变情况分为快代谢、中间代谢和慢代谢型。 • 医师可以根据代谢类型确定用药剂量，从而提高疗效和减少不良反 应。
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• 细胞色素P450 (cytochrome P450 )家族的一员，P450是肝脏药物代谢的主 要酶系。由P450酶负责代谢的药物中，12%由CYP2C19代谢。 • CYP2C19具有多种等位基因，CYP2C19﹡1（681G，636G）为野生型。最 常见的突变是CYP2C19﹡2和CYP2C19﹡3。 • 检测﹡2、﹡3两个位点，可覆盖99%以上中国突变人群。 CYP2C19 *1 *2 *3 突变位点 无突变 681G-A 636G-A 效应 野生型 突变型 突变型 亚洲人发生频率 65% 23-30% 5-13%
（特罗凯）
KRAS基因突变 结肠直肠癌
西妥昔单抗 （爱必妥） 帕尼单抗 （维克替尼）
BRAF基因突变
PIK3CA基因突变
19、20外显子
CKIT基因突变 慢性髓性白血病 PDGFRA基因突变
9、11、13、17外显子 伊马替尼 （格列卫） 12、18外显子
疾病
相关靶标基因
相关基因位点
药物名称
指导意义
高表达患者能明显提高生存率
高表达患者能明显提高生存率
Her2
曲妥珠单抗 （赫赛汀） 拉帕替尼
HER2基因高表达疗效好，低表达疗效差 PIK3CA 基因野生型患者疗效较好； PIK3CA 基因突变性患者， 疗效显著降低
9、20外显子
非小细胞肺癌
EML4-ALK融合 基因
EML4-ALK
克唑替尼
ALK基因表达患者疗效较好
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精准医疗的作用
1
提高治疗的有效性
2
降低药物的副作用
3
节约医疗的费用
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精准医学贯穿整个疾病预防和诊疗过程
预防
确定风险人 群，实现精 准预防
诊断
实现疾病的 早期诊断和 精确分类
治疗
优化治疗策略， 提高疗效、降 低副作用
提高 健康 水平
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精准医疗模式
传统治疗模式：“反复探索”医学
观察 诊断 治疗 安全/毒性 有效/无效
女阴癌
16、18
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3.3.2 遗传性耳聋基因检测
遗传是耳聋最大病因
耳
遗传因素 （约60%）
聋
不明原因（约20%）
环境因素（约20%）
非综合征型（70%）
综合征型（30%）
常染色体隐性（80%）
常染色体显性（15%-20%）
性连锁（< 1%） 线粒体 （< 1%）
Alport 综合征 Pendred综合征 Waardenburg综合征 BOR综合征 Usher综合征 ……等
调整用药
精准医疗模式：“量体裁衣”医学
观察 诊断 基因检测 治疗 安全有效
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3.3 基因检测临床应用实例
• HPV基因分型 • 遗传性耳聋基因检测 • 药物代谢基因检测
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3.3.1HPV基因分型
原理：核酸分子杂交是指两条DNA链或两条RNA链 或一条DNA链或一条RNA链按碱基互补的原则缔合成 异质双链的过程。