植物染色体原位杂交汇总

染色体原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补 配对的原则(A—T，G—C)，将有放射性和非放射 性标记的探针与染色体上经过变性后的单链 DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子， 再经过一定的检测手段将待测核酸在染色体上的 位置显示出来。
原位杂交技术主要方法
一、荧光原位杂交 二、基因组原位杂交 三、原位PCR 四、引物原位杂交技术 五、原位杂交结合显带标记技术 六、原位杂交结合免疫组织化学的双标记技术 七、电镜原位杂交技术 八、整体荧光原位杂交技术 九、DNA纤维荧光原位杂交 fiber-FISH
1、DNA 8 µl，100 ℃煮沸，立即冰浴10min左右，室温，加 标记物2 µl，充分混匀，37 ℃16h以上 2、杂交缓冲液配制 3、杂交液配制 杂交缓冲液+探针（2 µg/ µl ）+封阻DNA，变性再复性，室 温离心收集溶液
rDNA
在高等真核生物中，核糖体是合成蛋白质的场所。一个完整的 核糖体由60S、40S大小亚基组成，构成核糖体亚基的主要成分是 核糖体-RNA(rRNA)与蛋白质的复合物。
其中rRNA有4种类型，即18SrRNA、5.8S rRNA、28S rRNA和 5S rRNA。编Hale Waihona Puke Baidu这几种rRNA的基因有2种，一种为45S rDNA， 另一种为5S rDNA。
45S rDNA是高度保守串联重复序列．有几千拷贝数，特异 定位于染色体的核仁组织区(Nucleolar Organizing Region,NOR)，细胞形态学上显示为次缢痕，其远端是随体 (satellite)。
而5S rDNA虽然也是串联重复序列，但其并不位于核仁组 织区上。
三、杂交 5．取10-20ul杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装于80℃ 共变性10分钟 6．转入37℃水浴中杂交过夜
四、洗脱和信号检测
7．杂交制片用2SSC漂洗去盖片，0.1％SDS(2SSC配 制)37℃3×5分钟，0.1％SDS(0．2％SSC配制) 37℃3×5 分钟，2SSC室温下冲洗2次，甩干制片。
4. 杂交
5.杂交后处理（解离非特异性结合的双链， 除去未杂交的探针）
6.杂交体的检测（杂交DNA呈现颜色A,未 杂交的呈现颜色B）
原位杂交技术流程
一、染色体制片的准备 1．制片在60℃烘箱中干燥过夜 2．用100ul／ml的RNaseA(2SSC配制)，37℃小时，2SSC
漂去盖片，2SSC3×5分钟洗涤，70％--95％一100％乙醇 脱水，每级3分钟。 3．用0.01％Pepsin(10mMHCI配制)，37℃，20-40分钟， 1×PBS2×5分钟。 4．1％甲醛(50MmMgCl2，1XPBS配制)于室温下固定5分钟， 2SSC3×5分钟。
其编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动植物系统 发育与进化的一个有用标记，而且由于该基因为高度重复序列， 在近缘物种中发生着位于染色体上的位点以及同一位点基因拷 贝数多少的变化，因而通过rDNA-FISH技术对其在染色体上 分布的位置、位点以及拷贝数多少进行比较研究，可以确定近 缘物种的亲缘进化关系及起源。
二、基因组原位杂交
• (Genome in situ Hybridization) • 基因组原位杂交是在分子水平上检测外源染色质
的一种有效方法,其探针是总基因组DNA.该技术 广泛应用于植物进化和亲缘关系的鉴定上。
三、原位PCR
• 原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与 原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测 单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。
二、杂交混合液的准备 • 20ul杂交混合液： • 10ul去离子甲酰胺 • 4ul硫酸葡聚糖 • 2u120SSC • 1ul探针，2ul封阻DNA在涡流混合器上混匀 • 在PCR仪上97℃变性10分钟，迅速转入冰水中 至少10分
钟
二、探针及杂交液的准备 1、基因组DNA——改良CTAB法 2、rDNA（45S和5S）——含有目的基因的质粒DNA
植物染色体原位杂交技术
• 原位杂交[In situ hybridization，简称ISH]，也
称作杂交组织化学或细胞学的杂交，是一种能够从 形态学上证明特异性的DNA或RNA序列存在于个 别细胞、组织部分，单细胞或染色体中的技术，是 分子生物学和组织化学、细胞学结合的产物。
• 原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术 衍生而来，包括染色体原位杂交和RNA原位杂交， 其基本原理是：含有互补顺序的标记DNA或RNA 片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内的DNA或 RNA形成稳定的杂交体。
一、荧光原位杂交
• (Fluorescence in situ Hybridization)
是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质 标记（间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探 针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微 镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的 前提下对靶核酸进行分析。 • DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此 探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因 水平的分析。
• 原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织 细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性， 当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核 苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细 胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。
• 扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜 或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内 单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极 扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。
四、引物原位杂交技术
• 是通过退火一个寡核苷酸DNA 引物到制备在载 玻片上的染色体的变性 DNA 上 ,用渗入 的标记 核苷酸在原位进行酶促延长并进行检测的染色体 标记技术
染色体原位杂交简单流程图
探针
1.分离DNA 2.标记 3.变性
靶子
1. 染色体的制片准备 2. 杂交前处理 3.变性
单链DNA