流感病毒分离培养SOP
流感病毒的收集与纯化标准操作规
流感病毒的收集与纯化标准操作规程（编号：054）1、目的及适用范围该SOP用来规范流感病毒的收集和纯化标准操作。
2、主要仪器试剂超净工作台、冷冻立式超速离心机（BeckmanXL90）、冷冻台式高速离心机、天平、超速离心管、50mL离心管、0.01 mol/L PBS pH7.4、30%、40%、50%、60%蔗糖3、操作步骤3.1将病毒接种于SPF鸡胚，48 h收集尿囊液以5000 rpm（#3334）离心30 min，取上清液；或者将病毒接种于细胞，待细胞基本病变收取上清。
12000rpm（#3332），离心15min，去上清。
3.2 将上清液以100000g（Ti40）离心2 h，将沉淀物用1 mL 0.01 mol/L PBS pH7.4悬浮，振荡均匀；3.3 加至依次由30%、40%、50%、60%蔗糖制成的密度梯度上，以100000g（SW40）离心2h，取沉淀条带；3.4 取沉淀条带加10倍量PBS悬浮、振匀，再次以100000g （Ti80）离心2 h，取沉淀用200μL 0.01 mol/L PBS pH7.4或20 mM Hepes/20mM Mes/130mM NaCl, pH7.5悬浮、振匀，-80℃保存。
4、注意事项4.1 注意对称平衡。
使用天平，进行配平，保证离心对称平衡。
4.2 如离心管盖子密封性差液体就不能加满（针对高速离心且使用角度头），以防外溢。
外溢后果污染转头和离心腔，并失去平衡，影响感应器正常工作。
最高液面查离心机相应说明书。
4.3 SW40超速离心时，液体一定要加满离心管，只余留2mm空间，超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。
4.4 使用角度头时别忘盖转头盖，如未盖，离心腔内会产生很大的涡流阻力和摩擦升温，这等于给离心机的电机和制冷机增加了额外负担，影响离心机的使用寿命。
113。
流感病毒的分离培养
适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
标准操作规程(SOP)——禽流感病毒RT PCR 检测
一、目的确保疑似禽流感病例标本得到有效的检测，为禽流感病毒感染提供可靠的实验室诊断依据。
国家流感中心实验室按照规定方法对疑似禽流感感染病例的标本进行处理和检测，使疑似禽流感病例标本的处理和检测得到有效的控制。
保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
二、范围适用于中国国家流感中心所有技术人员进行疑似禽流感病例标本的检测。
三、背景本SOP 是为配合疑似H5N1禽流感感染病例的诊断而制定，确保禽流感病例诊断的快速性和可靠性，同时要求实验操作过程中标本不被污染或污染环境。
四、程序（一）生物安全要求分装标本、裂解病毒需在BSL-3级实验室操作；核酸提取可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR 反应体系配制在体系配制区；PCR 产物检测在电泳区操作。
要遵守相应生物安全规定（见“生物安全个人防护SOP ”）。
（二）材料及仪器1．提RNA Kit ：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog #74104）2．β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）3．70％乙醇4．RT-PCR Kit ：QIAGEN One step RT-PCR Kit （catalog #210212）5．Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）6．检测引物：Forword and Reverse Primers （均为10μM ），序列如下：标准操作规程（SOP ）——PCR 检测类型序列甲型通用FluA-M-F173FluA-M-R3825’-GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C-3’5’-AGC TGA GTG CGA CCT CCT TAG-3’H5 H5HA-F920H5HA-R11385’-GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC-3’5’-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3’N1 AN1-F550AN1-R11645’-TTG CTT GGT CAG CAA GTG C-3’5’-CAG TCA CAC CAT TTG GA TCC-3’H7 H7HA-F245H7HA-R4285’-CCC AAT GTG AYC AAT TCC T-3’5’-GCT CCA TTR GTT CTT ATT CC-3’N7 N7-F1126N7-R14075’-ATG YTG AAR ATA CCT AAT GC-3’5’-GTA TTN GAT YTG TGC CCC ATC-3’H9 H9HA-F426H9HA-R8085’-GAA TCC AGA TCT TTC CAG AC-3’5’-CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG-3’N2AN2-F1121AN2-R14015’-CGC TAC GGT TAT GAG ACT TTC AG-3’5’-ATA TTC GCC CCA TCA GGC CAT GAG-3’ 7．Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C8．Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C9．Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头10．BIOHIT 10μL，100μL，200μL，1000μL加样器11．可调转速14K离心机：Eppendorf 5417R12．旋涡混合器：QL-901（国产）13．生物安全柜：LABCONCO（CLASS11）14．PCR仪：Biometra15．琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 10168516．核酸染料：Gold View，北京赛百盛基因技术有限公司，cat# HGV－1。
流感病毒细胞分离培养
2、MDCK细胞传代
• （1）先把需用的Eagle’s和Versene放37℃水浴预温， 其它试剂不得放入。 • （ 2 ） 已 成 片 的 MDCK 细 胞 ， 将 其 生 长 液 倒 掉 。 用 Versene洗2遍。 • （3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。 • （4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成 片，表明消化时间未到。 • （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37℃ 2’–3’， 取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液， 稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3 天需传一代。
（一）MDCK细胞分离流感病毒 MDCK细胞分离流感病毒 细胞分离
1、实验材料：
• MDCK细胞（最好是早代的） • Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰胺 的以抽滤为好） • Hank氏溶液 • 0.25%胰酶和Versene消化液 • 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真 菌素 • 胎牛或小牛血清 • 5.6%或7.5%的NaHCO3.
2012-4-17 7
• （5）无菌条件：细胞培养的关键之一是要有无菌概 无菌条件： 念，要防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来 源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本 身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进 行彻底消毒，在操作时要严格实行无菌操作。 • （6） 培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对 培养器皿的处理： 于细胞的贴壁生长影响很大。常用的器皿主要有玻璃 及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜、 清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。塑料板 一般用2%NaOH浸泡1小时后，清水洗净再用1N HCl 浸泡1小时，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥 后，紫外线照射消毒。
4 流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
流感病毒的分离鉴定(二)
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对
照
0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
摇匀置室温60～90分钟
结果
++++ ++++ ++++ +++ ++ ++
▪ 目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。
▪ 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。
(5)稀释完毕后加人体积分数为0．5％的压积鸡红 细胞悬液，每管0．2mL,室温放置30~60mn。
流感病毒血凝试验
试管号
12 3 4 5
67
8
9
10
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
边缘不整齐。
“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
流感病毒的分离技术操作规范
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK 细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1. 流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2. 流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1. 试验材料（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMA T8802）（3）HEPES缓冲液,1M母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's 液（5）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素)（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7）处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：1mL和10mL2. 培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25％)c) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2）病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。
标准操作规程(SOP)——血清标本采集及储存
一、目的急性期（<7d ）或恢复期（病后2～4周）血清抗体效价测定是流感诊断的主要方法之一，血清标本也可用于病毒核酸PCR 及病毒分离。
为保证样品质量、不被污染、采样过程安全及保护环境，中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的规程进行操作。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行血清标本的采集及储存。
三、程序（一）生物安全要求采集禽流感疑似病例急性期血清时，应以BSL-3级标准进行防护，可在BSL-2实验室分离。
采集禽流感疑似病例密接病例血清，按BSL-2级防护。
详见生物安全个人防护SOP 。
（二）材料1．BD 负压取血管 Ref.367955 5mL2．BD 采血配件 Ref.367237 成人或大于等于7岁儿童3．BD 采血配件 Ref.367238 用于小于7岁儿童4．2%碘酒，75%酒精，无菌棉签，压脉带（三）实验步骤1．采样（1）被采集对象如是急性期禽流感医学观察病例、确诊病例或疑似病例，应以BSL-3级标准进行防护，穿戴防护用品顺序：戴帽子-穿一次性医用手术衣-穿防护服-戴口罩-戴上防护眼镜-穿上鞋套、或胶鞋-戴上手套,将手套套在防护服袖口外面，进入病例所处核心污染区。
采集禽流感疑似病例密接病例血清，按BSL-2级防护，穿戴防护用品顺序：戴帽子-穿一标准操作规程（SOP ）储存次性医用手术衣-戴口罩-戴上防护眼镜-穿上鞋套或胶鞋-戴上手套,将手套套在防护服袖口外面，选择干净相对无菌条件下操作。
（2）标记采血管，包括被采集对象编号、姓名、性别、年龄，准备适当规格的采血配件及负压取血管。
务必仔细核对并记录。
（3）根据被采集对象具体情况，可选择肘前静脉、手背静脉或颈静脉（常用于小于3岁儿童）。
在扎上止血带后，拍打注射部位3－4次，还可用大拇指按压静脉2－3次，一般静脉受刺激后血管扩张血液充盈即可明显暴露，如果暴露还是不明显，可用右手食指沿解剖部位触摸，静脉的感觉柔软且富有弹性，并呈条索状。
标准操作规程(SOP)——流感禽流感灭活抗原的制备和纯化
该文件用以说明流感、禽流感灭活抗原的制备和纯化的操作规范。
流感/禽流感灭活抗原是为国家流感中心、全国各网络实验室提供季节性流感以及禽流感疫情监测用的参比抗原，该操作规范确保参比抗原的质量得到有效控制，保证参比抗原不被污染和污染环境。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化。
三、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。
操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。
（二）材料1．鸡胚：9-10日龄SPF 鸡胚试剂：多聚甲醛，β-丙内酯（取 2 g 于100mL 冰浴过的双蒸水中），7.5%BSA ，7%的Na 2HCO 3，0.5M 磷酸氢二钠缓冲液，无菌PBS 100mmol/L ，pH 7.2~7.4，浓度分别为60%和30%的灭菌蔗糖溶液，75% 酒精，蔗糖，T75细胞瓶。
2．仪器：照卵灯，鸡卵开孔器， 天平，超速离心机，离心管等。
（三）实验步骤1．病毒制备（见流感病毒的鸡胚分离方法SOP ）2．灭活抗原一、目的标准操作规程（SOP ）——（1）禽流感病毒的灭活1）根据鸡胚尿囊腔内收获的量，用移液管吸取多聚甲醛，加入收获的病毒液内，使多聚甲醛的终浓度为1‰。
2）加入多聚甲醛后，立刻充分混匀，并置4ºC放置48h。
3）48h后，将多聚甲醛作用过的病毒液接种9日龄鸡胚进行三次安检盲传，每一种灭活抗原每次安检需接种3~4枚鸡胚（鸡胚接种见鸡胚分离流感病毒SOP）。
4）盲传后收集的鸡胚尿囊液，取部分做HA试验，如果结果为阴性则为灭活安检合格。
5）按此共进行三次安检盲传，如果三次检测均为阴性，则灭活成功，方可安全拿出生物安全三级实验室（BSL-3），供相关实验所需；如果未达到三次安检均合格，则需要再次进行灭活，直至安检合格为止。
标准操作规程(SOP)H5N1 流感病毒ELISA 抗体检测方法的建立
本标准操作规程（SOP ）规定了H5N1流感病毒ELISA 抗体检测实验的程序和相应的操作。
本SOP 为规范实验操作、保证样本质量、操作安全而制定。
二、范围中国国家流感中心的所有技术人员使用ELISA 进行H5N1流感病毒抗体检测。
三、责任实验室操作人员严格按要求执行。
四、定义标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。
五、程序（一）生物安全要求检测疑似人高致病性禽流感病例和不明原因肺炎病人血清标本时，血清标本的灭活处理需要在BSL-3级实验室操作，操作人员需以BSL-3级防护。
血清灭活后的检测实验需在BSL-2级实验室操作，操作人员需以BSL-2级防护。
（二）材料1．设备和材料恒温水浴箱：长风 HHW21 微量振荡器：国华 ZW-A 酶标仪：Thermo MK3 洗板机：Thermo WellWashPlus 精确移液器：单通道可调 1－10μL 、20-200μL 、100-1000μL 12通道可调 20-200μL一、目的标准操作规程（SOP ）H5N1ELISA专用试剂槽2．试剂（1）抗原包被液：50mmol/L pH9.6的碳酸缓冲稀释液。
碳酸钠0.79g，碳酸氢钠1.46g，去离子水500mL。
注明配制时间，填写配制记录，配制好的抗原包被液保存在4ºC。
（2）抗原使用杆状病毒表达纯化的HA蛋白（购自 Proteinscience 公司）、有关的抗原应该使用每次监测时流行毒株表达的蛋白作为抗原。
（3）洗液：含0.05％Tween20 ( Sigma Cat# P3563 )PBS，（4）封闭液：2%脱脂奶。
2 mL脱脂奶加入至100mLPBS中。
注明配制时间，填写配制记录，配制好的封闭液保存在4ºC。
（5）样品稀释液：含1%BSA （ Gibco Cat＃15260）PBS（6）阳性对照血清： H5流感病毒阳性的人血清或羊血清（7）阴性对照血清：正常人群血清（8）酶标记物稀释液：含1%BSA PBS（9）辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（sigma公司）使用浓度：1:6000 （10）TMB显色液：北京万泰公司（11）终止液：北京万泰公司（三）实验步骤1．洗板程序：自动洗板机上编程，为H5N1流感病毒抗体检测洗板程序。
标准操作规程(SOP)——流感病毒的鸡胚分离方法
一、目的流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。
本SOP 是为确保鸡胚分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感病毒的鸡胚分离。
三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3。
实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。
H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
其余流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2。
实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。
其余流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料1．9～11日龄SPF 鸡胚2．照卵灯3．70%～75％酒精4．一次性注射器5．鸡蛋开孔器6．蜡或医用胶布7．液体石蜡8．15mL 无菌离心管、试管架标准操作规程（SOP ）——分离方法9．10mL无菌移液管10．无菌镊子。
（三）实验步骤1．验卵（1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。
（2）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。
（3）如何判断鸡胚状态1）血管：活胚血管清晰，死胚模糊，成淤血带或淤血块2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。
3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。
2．鸡胚接种（1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。
（2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10×6mm裂口。
（3）用注射器吸200µL处理过的临床标本，装上16号针头。
（4）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。
标准操作规程(SOP)——红细胞凝集抑制试验鉴定流感禽流感病毒方法
本SOP 是为了规范红细胞凝集抑制试验（HI ，hemagglutination inhibition test ）的操作规程，确保试验质量而制定。
二、范围适用于中国国家流感中心所有技术人员进行红细胞凝集抑制试验，鉴定流感/禽流感病毒。
三、程序（一）生物安全要求季节性流感病毒及经完全灭活的高致病禽流感病毒和H2N2流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，操作人员采取BSL-2级防护。
禽流感H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行，操作人员采取BSL-3级防护。
具体防护参见“流感中心生物安全个人防护SOP ”。
（二）材料1．流感病毒参比抗原及参比抗血清2．待检病毒3．1%红细胞悬液（鸡、豚鼠红细胞，由于“O ”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞）4．磷酸缓冲液（PBS ），0.01M ，pH 7.4 (Sigma P 3813)5．多道及单道可调加样器单通道可调加样器量程为 20μL ～200μL 、200μL ～1000μL8通道或12道可调加样器量程为 20μL ～200μL6．96孔微量板：鸡红细胞选择“V ”型或“U ”型底微量板；豚鼠红细胞选一、目的标准操作规程（SOP ）——试验鉴定流感/择“U”型底微量板。
7．其它耗材，200μL、1000μL滴头、试管、加样槽等。
（三）实验步骤1．试验前准备（1）PBS配制：按照Sigma的说明书的要求配制PBS缓冲液。
121℃高压灭菌20min，分装，4℃储存。
（2）1%红细胞悬液：按照“1%鸡红细胞悬液配制SOP、1%豚鼠红细胞悬液配制SOP”配制红细胞悬液。
（3）制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原1）一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。
进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25μL体积中含有4个红细胞凝集单位）的病毒量。
流感病毒的分离培养与鉴定
流感病毒的分离培养与鉴定一．实验目的1.掌握临床呼吸道病毒感染标本的采集、处理及送检原则。
2.掌握病毒滴度测定—红细胞凝集试验原理。
3.熟悉流感病毒的分离培养---鸡胚尿囊腔接种技术。
4.熟悉鸡胚尿囊液收集方法；红细胞凝集试验操作方法、结果观察及病毒滴度判定。
二．实验原理1.病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一,流感监测最主要的目的为:及时发现并抓住有意义的流感病毒新变种,尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报，因此,在流感诊断中任何方法都不能完全替代病毒分离这一方法，通常多用鸡胚来分离流感病毒。
2.3.血球凝集试验原理：某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集多种哺乳类动物和鸟类的红细胞,出现红细胞凝集现象，简称血凝现象。
这是由于流感病毒表面的血凝素是糖蛋白成分，红细胞表面有糖蛋白的受体,流感病毒血凝素结合在红细胞表面的糖蛋白受体上,从而发生红细胞凝集。
三．实验步骤1.标本采集→杀灭杂菌→接种→鉴定病毒类型2.培养：(1)取孵育10~12d鸡胚,在检卵灯下画出气室界线,于胚胎附近无大血管处画出标记作为注射入口。
(2)将卵置于卵架上,消毒标记处,用无菌剪刀尖在标记处打一小孔。
(3用灭菌注射器吸取流感病毒液0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射。
(4)注射后,用无菌胶布封孔,置35度温箱孵育。
(5)每日在灯下检视鸡胚情况(若鸡胚在接种后24h内死亡为非特异性死亡,应弃之)。
3.鉴定：(1)取小试管9支（或采用塑料凹孔板）,于第一管加入生理盐水0.9毫升,其余各管均加入0.25毫升。
(2)于第一管注入羊水或尿囊液0.1毫升，充分混匀,吸出0.75毫升,于第二管注入0.25毫升,其余0.25毫升弃入消毒液中(切不可乱弃）。
从第2管起对倍稀释至第8管。
(3)各管加入0.5%鸡RBC 0. 25m1，摇匀后室温静置60分钟。
30分、45分、60分各观察结果一次,以阴性对照红细胞沉积结果为准。
标准操作规程（SOP）——蔗糖密度梯度离心纯化流感病毒
标准操作规程（SOP）——一、目的流感病毒的浓缩和纯化方式可以分为物理和化学的方法。
如：超速离心法，酸沉淀法，红细胞吸附-释放法，蒸馏水透析法及聚乙二醇浓缩法等。
其中超速离心法最为常用并且纯度较高。
本SOP明确流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化的标准操作方法，保证了实验结果的职能却可靠。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行蔗糖密度梯度离心纯化流感病毒。
三、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。
操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP”（二）材料1．病毒液2．PBS（100mmol/L pH7.2）液3．30%和60%蔗糖溶液4．耗材（注射器，离心管，吸管，实验滤纸）（三）实验步骤1．将待纯化的流感病毒种子株接种鸡胚或者MDCK细胞，收获病毒尿囊液。
具体接种方法参见“流感病毒的鸡胚分离方法SOP”和“MDCK细胞分离流感病毒SOP”。
2．将流感病毒收获的鸡胚尿囊液使用实验滤纸粗滤，以去除蛋壳或者其它沉淀物。
MDCK细胞培养的病毒收获液可以省略此步骤。
3．收集过滤液，使用SIGMA3K18 高速离心及2000rpm离心20min，去沉渣。
4．将上清使用OptimaTM L-80XP 超速离心机30000rpm的转速离心1h，去上清。
加入100mmol/L pH7.2的PBS液数滴浸泡沉淀，置4℃冰箱过夜。
5．制备蔗糖梯度管，用10mL吸管加5mL的60%的蔗糖溶液于管底，在其上小心加入10mL的30%的蔗糖溶液。
在其上缓慢加入20mL病毒悬液。
6．使用OptimaTM L-80XP 超速离心机20000rpm的转速离心1.5h，取出离心管。
使用注射器小心吸取位于30%和60%之间的靠近管底的病毒条带。
7．于所收获的液体加入5倍体积的PBS液，混匀后30000rpm的转速离心1h，去上清。
标准操作规程(SOP)——流感毒株的复苏
标准操作规程（SOP）——
一、目的
本SOP是为了规范流感干燥毒株的复苏、确保毒株复苏的质量而制定。
二、范围
适用于中国国际流感中心所有技术人员进行流感毒株的复苏。
三、程序
（一）生物安全要求
季节性流感毒株的复苏在BSL-2级实验室里操作，采取生物安全二级个人防护。
高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行，采取生物安全三级防护，具体防护参见“流感中心生物安全个人防护SOP”。
（二）材料
磷酸缓冲液（PBS），0.01M，pH 7.4 (Sigma P 3813)，9日龄SPF鸡胚或70－90%成片的MDCK细胞，干燥保存毒株，1mL注射器及200μL待滤芯移液器头等耗材。
（三）实验步骤
1．试验操作人员进入实验室按照规定进行相应级别的个人防护。
2．PBS配制：按照Sigma的说明书的要求配制PBS缓冲液。
121℃高压灭菌15min，分装，4℃储存。
3．对于鸡胚来源的干燥保存毒株，采用鸡胚复苏；MDCK来源的干燥毒株采用MDCK细胞复苏。
4．在生物安全规内打开干燥毒株保存管，用1.8mL PBS充分使其溶解。
5．将溶解物200µL分别接种9日龄鸡胚4枚或MDCK细胞（见MDCK细胞病毒分离SOP）。
6．48h后收获鸡胚尿囊液，采用HA试验检测培养物的HA滴度。
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1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
必要时可以摇动或吹打来分离细胞。
然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
2.3.7 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
2.3.8 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）。
2.3.9 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。
通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
2.3.10 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
3. 流感病毒细胞分离程序3.1 生物安全要求流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。
实验操作人员需进行BSL-2防护。
流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
3.2 材料3.2.1 75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离3.2.2 胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3.2.3 HEPES缓冲液，1M母液3.2.4 D-MEM培养基，Hank's液3.2.5 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G；10000 μg/mL硫酸链霉素）3.2.6 牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液3.2.7 临床样品0.5mL3.2.8 1mL无菌移液管3.2.9 10mL无菌移液管3.2.10 15mL无菌离心管3.3 实验步骤3.3.1 细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL 青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
3.3.2 病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2μg/mL。
3.3.3 流感病毒MDCK细胞分离步骤：3.3.3.1 75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。
a）用40×物镜观察细胞生长状态。
b）轻轻倒出细胞生长液，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
a）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。
b）用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。
c）然后放于35℃5% CO2培养箱中吸附1～2h。
d）吸出接种物，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。
然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。
e）放置于33～35℃培养箱培养。
f）每日观察细胞病变情况。
（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
3.3.3.3 细胞培养物的收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。
即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。
收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10 mL 的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。
收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。
4. 流感病毒的鉴定至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便、易行、结果可信。
HI试验分常量法和微量法两种。
微量HI法是目前国际普遍使用的方法，也是WHO流感监测中推荐使用的标准方法。
HI试验的原理是流感病毒表面具有的血凝素蛋白能和含有唾液酸的受体物质特异结合，红血球浆膜上含有这类物质，当一定量病毒和适当比例的红血球混合后发生凝集，此为血凝现象。
而用流感病毒特异性抗体和病毒作用，干扰了病毒和红血球的结合从而抑制了血凝，此为血凝抑制现象。
这就是传统流感病毒的鉴定的理论依据。
微量HI法实验步骤如下：4.1 生物安全要求流感病毒的鉴定实验室生物安全级别：BSL-2。
实验操作人员需进行BSL-2防护。
流感病毒的鉴定操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
4.2 实验材料4.2.1 分离培养物（标本）4.2.2 标准血清：常规鉴定用，包括甲1、甲3和乙型流感代表株的至少3种抗体；4.2.3 红血球：0.75%人“O”型红细胞4.2.4 受体破坏酶（RDE）4.2.5 PBS或生理盐水4.2.6 96孔微量板4.2.7 可调多通道移液器和单通道移液器及滴头4.2.8 其他水浴箱等4.3 HI试验操作过程4.3.1 加PBS或生理盐水25ul于96孔板的第B行至H行的每一孔。
4.3.2 加1：10稀释的经受体破坏酶处理过的标准血清50ul于A行的每一孔。
4.3.3 用多通道移液器从A行各孔取25ul血清，倍比稀释至H排各孔，弃去25ul。
4.3.4 25ul被检病毒的4个血凝单位抗原加至各孔，混匀，室温静置15-30min，4.3.5 然后加50ul的红血球（0.5%鸡红细胞或0.75%豚鼠红细胞），4.3.6 室温静置30-60min（鸡血球30min；豚鼠血球60min）后观察结果。
4.3.7 结果判定：血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。
4.4 受体破坏酶处理血清目的是去除非特异性血凝抑制素。
因为人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素，它们是游离在血清中类似病毒受体的唾液酸残基，能与病毒血凝素分子上的受体结合，会竞争抑制病毒与红血球的结合，因而造成假阳性，因此HI试验必须用受体破坏酶处理血清。
具体操作如下：4.4.1 3体积的RDE，1体积的血清（0.3ml RDE ：0.1ml血清）混合。
4.4.2 37℃水浴过夜。
4.4.3 56℃30min失活。
4.4.4 加入6体积的PBS或生理盐水混合，使血清稀释为1：10备用。
或者按4：1处理后，倍比稀释为1：10备用。
4.5 去除非特异性凝集素处理过的血清可能与红细胞发生非特异性凝集。
如血清中存在非特异性凝集，按下述方法处理：4.5.1 用1体积的红细胞和20体积的RDE处理过的血清充分混匀。
4.5.2 搁置4℃1小时，其间使沉降红细胞再悬浮、混匀。
4.5.3 900 X g 5min离心。
4.5.4 取上清，反复上述操作直至血清与红细胞的吸附阴性为止。
4.6 4个血凝单位抗原的调制病毒培养阳性的标本首先确定其HA滴度，在此基础上调制4个血凝单位抗原，用于HI 试验。
HA测定和4个血凝单位抗原的调制方法如下：4.6.1 HA测定a）50ul的PBS或盐水加入96孔微量板A-H行的2-12孔。
b）被检病毒各50ul分别加入A-H行的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50ul，12孔为阴性对照。
c）加50ul的红细胞于每一孔，注意从低浓度至高浓度加入。
d）混匀、室温静止30min（鸡血）或60min（豚鼠血）。
e）确定HA滴度：完全血凝的最高稀释度的倒数为血凝滴度。
完全凝集为+，不完全凝集+/-，无凝集为-。
4.6.2 4个血凝单位的调制和再确认（复核）4.6.2.1 调制4个血凝单位1个血凝单位指能引起等量红细胞凝集的病毒量。
HI滴度是基于此测定的。
试验中需调制4个血凝单位，首先根据HA滴度，用8除其商为8个血凝单位的稀释度。
如某待检病毒的HA滴度为160，除8等于20。
即1：20（某标准参比抗原病毒0.1ml 加 1.9ml PBS）稀释病毒即得到8个血凝单位。
注意HI试验所需4个血凝单位指25ul病毒含4个血凝单位，而第二步确定所稀释病毒是否为4个血凝单位的HA试验用50ul体系，所以先调制为8个血凝单位。
确认4个血凝单位试验的具体操作如下：a）50ul的PBS或盐水加入96孔板的第2-12孔。
b）调制的8个血凝单位抗原100ul加入第一孔，然后倍比稀释至第6孔弃去50ul。
c）各孔加红血球50ul混匀，视血球的不同静置30-60min观察结果。
4.6.2.2 结果判定：若第1、2、3、4孔完全凝集，第5孔不凝集，表明该稀释病毒准确，可用于HAI试验。
如果第5孔也完全凝集说明该50ul病毒含16个血凝单位，需等量稀释病毒，如果只有前3孔凝集，说明该50ul病毒含4个血凝单位，病毒量需加倍。
另外，注意4个血凝单位须每次用前新鲜配制。
4.7 HI试验鉴定未知病毒时注意事项4.7.1 正确选用96孔微量板，根据所用红血球不同来决定，鸡血球选用V型板，豚鼠、人血球用U型板。
4.7.2 红血球的浓度和4个血凝单位的正确调制。