骨组织脱钙技术及其应用

骨组织脱钙技术及其应用
张绪斌;熊正文;张华东;解放军第
【摘要】@@ 骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的.
【期刊名称】《医学理论与实践》
【年(卷),期】2011(024)011
【总页数】4页(P1264-1267)
【关键词】骨组织;脱钙技术;应用
【作者】张绪斌;熊正文;张华东;解放军第
【作者单位】解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000
【正文语种】中文
【中图分类】R954.65;R392.1
骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的。

无机盐以羟基磷灰石结晶的形式存在,其中绝大部分为水合磷酸钙,此外还包括微量碳酸盐和柠檬酸盐等[1,2],因此骨和其他一些已钙化的组织在脱水、透明等制片前必须将组织中的钙盐用脱钙剂除去,才能制成4～5μm厚的切片。

目前,常用的脱钙剂主要有单纯酸类、
混合酸类、螯合剂、离子交换树脂和电解脱钙等方法[3～6],尤其是近年来应用微波技术辅助脱钙明显缩短了脱钙时间,改善了HE、组织化学、免疫组织化学染色和原位杂交[7～11]。

现将骨组织的脱钙技术及应用等有关内容简介如下。

1 骨组织的组织学特点[1,2]
骨组织由骨基质和骨细胞组成,骨基质是由有机物质和无机物质紧密结合而成,主要成分有:(1)胶原纤维:为Ⅰ型胶原;(2)粘蛋白:为胶原纤维间的无定型物质;(3)骨盐:主要是羟基磷灰石;(4)酶:包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和胶原酶等。

软骨基质是由软骨母细胞分泌丰富的蛋白多糖组成的,HE染色呈淡蓝色,A lcian蓝染色阳性(蓝色),甲苯胺蓝呈异染性反应(紫红色),软骨的胶原属Ⅱ型胶原。

骨及软骨的细胞成分有:(1)骨母细胞,其形态与静止及活跃状态有关,前者呈梭形;后者常为多边形或椭圆形。

胞体大、核偏位、胞浆丰富、嗜碱性。

骨母细胞能产生骨样基质,由骨样基质与其周边的骨母细胞构成了骨样组织,HE染色呈粉红;(2)骨细胞位于骨陷窝内,常呈小梭形;(3)软骨母细胞,胞体为卵圆形,常伴随软骨基质而存在;(4)破骨细胞(Osteoclast)为一种多核巨细胞,可有10～20个核,核淡染,有核仁,胞浆嗜酸有突起,电镜下可见微绒毛,破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和胶原酶。

2 骨组织的固定
由于骨组织致密、坚硬,并含有骨胶等成分,所以骨组织的固定、脱水、透明、包埋等都很困难。

不论是HE染色、组化染色,还是免疫组织化学染色都要求将组织及时固定,其目的是为了保存良好的组织形态结构、防止组织自溶,阻止内、外源性细胞内分解酶活性和保存某些特殊抗原[1,12]。

骨组织固定的方法主要有先固定后脱钙、固定脱钙同时进行和先脱钙后固定三种方式[13]。

常用的固定剂主要有福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇及碳化二亚铵等,它们都具有良好的固定作用。

固定不当对抗原性有很大的影响,主要表现在三个方面,一是组织过大固定时间不够,使组织中心部位的抗原溶解、弥散或丢失;二是在福
尔马林固定时间过长,因醛-氨基交联而降低抗原性;三是固定液的种类、浓度和温度对一些特殊抗原有很大的破坏作用[1,12]。

离体组织应采用10%的福尔马林或4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4)及时浸泡固定,也可用120～150W 的微波(microwave,MW)辅助固定液、或生理盐水固定3～5m in,组织块的大小以
1.2cm×0.8cm×0.2cm为好,需电镜检查的材料可加入0.05%～0.5%的戊二醛[2]。

3 骨组织的常用脱钙方法及脱钙液
3.1 单纯酸类脱钙剂主要有甲酸、硝酸、盐酸、三氯乙酸和硫酸等,尤其是甲酸和
硝酸在骨组织的脱钙中应用较其他单纯酸多[9,13]。

甲酸又称蚁酸,是一种良好的常规脱钙剂,其作用缓慢,对组织损害小,使用浓度5%～50%,浓度越高、脱钙时间越短,使用时应随时注意观察[9,13]。

通过对比5%、8%、10%和13%硝酸脱钙液的浓度,以8%～10%浓度的硝酸,脱钙效果最好。

8%硝酸室温下脱钙骨密质需要24～
36h,骨松质需要12～24h,蜡块中的组织块及切片均呈淡黄色,阳性免疫组织化学染色极差,背景较深。

硝酸是临床病理活检中最实用的一种常规脱钙剂,脱钙迅速、完
全可靠、作用强、时间短、效果好,但是对骨组织的破坏作用较大[13]。

采用低温MW-8%硝酸脱钙骨密质需要50～55min,骨松质需要30～35m in,其石蜡切片完整、HE染色对比好,IHCS标记阳性细胞比室温条件下硝酸脱钙的多、着色深、背
景最淡[5,6,9]。

使用硝酸脱钙时由于亚硝酸形成使组织呈黄色而影响其后的染色,
在室温条件下更明显,在纯硝酸中加入0.1%的尿素可防止变黄。

3.2 混合酸类脱钙剂混合酸类脱钙液是指两种酸类脱钙剂一起使用,或在单纯酸内
加入另一种脱钙剂或少量的其他试剂所配制的脱钙液,这类脱钙液的特点是脱钙完全、快速,防止纤维组织过度膨胀,减少组织破坏及对染色的影响。

通过加入不同的
化学成分可以弥补单纯酸类脱钙液的不足,所以混合酸类脱钙液越来越受到人们的
欢迎。

常用的混合酸类脱钙液主要有甲酸-甲醛脱钙液、甲酸-柠檬酸钠液、Schm orl's液、Von Ebner氏液、Jenkins氏液、Plank-Rycho 氏液、Richman 氏液、
Jy-Ⅰ 、Jy-Ⅱ氏液、Schcidde氏液等[9,13]。

3.3 螯合剂脱钙技术螯合剂属于有机化合物,因其可与金属离子结合而把它作为脱钙剂使用,如乙二胺四乙酸钠(EDTA)、柠檬酸钠等。

柠檬酸钠对组织损害较大、产生气泡、脱钙时间长,所以很少使用。

EDTA具有对组织破坏小、不产生气泡、不影响染色、pH值近中性等优点,所以使用较多。

在4%、7%、10%、13%和16%EDTA脱钙液浓度中,以10%、13%浓度的脱钙效果最好。

室温下使用EDTA 脱钙(20℃),骨密质需要 35～40d,骨松质需要30～35d,石蜡切片完整,HE染色对比好,IHCS阳性细胞数量多、着色深、背景淡。

低温MW-10%EDTA脱钙,骨密质需要9～10h,骨松质需要7～8h,石蜡切片、HE及IHCS比室温条件下脱钙好、时间明显缩短[1,10,14]。

3.4 离子交换树脂技术离子交换树脂脱钙是一种非常理想的脱钙技术,它能使脱钙液中的钙离子快速除去,确保骨组织中钙能充分地、通畅地溶出,以最大程度地提高脱钙液的效率,加速脱钙速度,缩短脱钙时间,为HE、组化和免疫组化染色提供有利条件。

其方法是将氨型磺化聚苯乙烯树脂铺在脱钙容器底部厚度约1.5cm,将脱钙组织放在树脂上面,加入有机酸(不可加入无机酸)脱钙液,脱钙液的用量为脱钙组织体积的20～30倍[13]。

3.5 电解脱钙技术电解脱钙是将两电极插入脱钙液中,使脱钙液内有电流通过,将脱钙液中的钙离子吸引到阴极而发生电离作用,加速脱钙过程、缩短脱钙时间,尤其是大量标本脱钙或是标本体积大时效果更好。

电解脱钙的原理是在容器内装脱钙液150m l,取一根铂金丝将标本缠绕数圈,放在容器一侧,铂金丝另一端连接电源正极,在容器另一侧,将一支钢片或炭精棒的下端插入电解脱钙液内,上端与电源负极相接,在正、负极之间隔置一块绝缘的有机玻璃或塑料板,以防电极接触而引起导电,将已装好的导电装置置于37～45℃恒温水浴箱中,接通电源即可脱钙。

此方法简便易行,染色效果好,一般数分钟至数小时即可完成脱钙[3]。

3.6 脱钙机脱钙技术近年来随着科学技术的不断发展,骨组织的脱钙技术也有了新的发展,利用超声波、电离等技术生产的脱钙机也应运而生,但由于经济状况和技术条件的限制,目前国内大部分实验室都还不具备这种设备。

脱钙机脱钙技术尚不十分完善,目前国外的脱钙机主要为加热恒温法、超声波法、电离法、真空负压法等,但这些方法都需要酸类脱钙剂参与,脱钙液对组织形态结构、抗原性的破坏,对染色的影响还是不可避免。

脱钙机加快了脱钙速度,缩短了脱钙时间,减少了长时间脱钙对组织形态结构、抗原性等的损害,使脱钙效果更好,解决了人工无法解决的许多技术难题[13]。

4 骨组织的低温-微波快速脱钙技术研究
4.1 微波特性生物物理学持性与应用 MW是一种高频电磁波,频率为300～300 000MHz,波长1mm～1m,生物医学中常用的频率为 2 450、915、434MHz,目前微波炉所用频率为2 450MH z,波长12.5cm。

MW的透入深度与频率成反比,与波长成正比,频率高,波长短,其辐射方向性好,能量易于集中,但透入深度小;反之则方向性差,能量不易于集中,透入深度大。

MW与光波不同,属于非电离辐射,不能使键能最弱的氢键断裂。

当MW作用于生物体或介质时,因吸收MW而使温度升高,发生热效应。

MW不发生热传递,热效应产生的多少与生物体内的水分、介质中的极性分子或离子浓度等成正比。

MW产热的原理是排列混乱的极性分子、离子等在电场力的作用下使它们振动、运动、相互摩擦、碰撞,而产生热量,使组织细胞或介质的温度升高[2,15]。

自从MW首次用于固定动物实验材料获得成功,随后大量的研究结果证实,MW在常规制片、冰冻切片、组化、免疫组化、原杂交和电镜制片等领域均获得了十分好的效果[2,8,11,16]。

国内外文献对临床病理活体检查骨组织的脱钙及脱钙液有较多的研究,但对IHCS所用材料的研究较少,国外学者在内耳的免疫组化研究中使用EDTA脱钙获得了较好的效果,但所需时间长达3～4周,有的甚至需数月(4～7个
月),很难满足临床活检病理诊断和研究的需要[10,17]。

4.2 骨组织的低温-微波快速脱钙技术研究根据MW热效应的原理,在对脱钙液的
种类、脱钙温度等进行较深入研究的基础上,将MW与硝酸、EDTA等脱钙液相结合,创用的“低温MW-快速脱钙技术”,使脱钙组织的组织形态结构、抗原性均得
到了很好的保存,而且脱钙时间显著缩短,在骨肿瘤和内耳等的IHCS中收到了很好
的效果[1,11,17]。

研究结果显示[1,2,18,19]:(1)钙液的温度对IHCS结果有十分明
显的影响,低温条件下脱钙对抗原性有很好的保护作用;(2)脱钙液的种类对抗原性无明显影响;(3)将低温微波技术与硝酸、甲酸和EDTA等脱钙方法结合,由于缩短了脱钙时间,使抗原性得到了很好的保存;(4)合理使用抗原修复技术可以使石蜡切片或冰冻切片的抗原性得到很好的恢复;(5)石蜡切片比冰冻切片能更好的保护组织形态结构。

4.3 低温MW-硝酸快速脱钙的方法[2,6,14] (1)取4～5个月龄豚鼠耳蜗、家兔的
后腿骨及骨肿瘤等待脱钙的骨及脱化组织,大小为l.2cm×0.8cm×0.4cm,用10%福尔马林固定12h、流水冲洗0.5～1h。

(2)在1 000m l的大烧杯内放500m l冰水。

(3)在500m l的小烧杯内放250m l经冰箱预冷的硝酸或EDTA脱钙液,然后放待
脱钙的组织。

(4)将小烧杯放入大量杯内,然后一同放入微波炉中。

(5)用2档(微波
输出功率250W)脱钙,并测量大、小烧杯中液体的温度。

当接近15℃时向大烧杯
中添加冰块,或向小烧杯中添加预冷的脱钙液,这样脱钙液温度不会迅速升高,又发挥了微波效应的作用,保证了脱钙液的温度始终控制在15℃以内。

低温MW-硝酸快
速脱钙技术的关键是通过脱钙液在冰箱中预冷、及时更换脱钙液和在装脱钙液容器之外的大容器中添加冰块,使脱钙液不至于因为微波热效应的作用而使温度迅速升高。

5 脱钙方法的对比研究
1993年Walsh等[7]对硝酸、蚁酸和EDTA 脱钙的组织进行了m RNA原位杂交,
他认为蚁酸和EDTA比硝酸能真实反应组织中m RNA实际含量。

Shibata等[8]
研究了 10%硝酸、10%盐酸、5%蚁酸、5%三氯醋酸、M orse液、Plank-Rycho 氏液和K-CX液共7种脱钙液对rRNA原位杂交染色效果的影响,结果显示5%蚁酸和 M orse液最好。

Yam am oto-Fuku等[9]也用DNA组织化染色和原位末端缺口标记评价了10%EDTA、5%三醋酸、Morse液、5%蚁酸、5%盐酸、10%硝酸、Plank-Rycho氏液和K-CX液共8种脱钙液的脱钙效果,结果显示 10%EDTA、5%三氯醋酸、M orse液和5%蚁酸可用于DNA组织化学染色;10%EDTA、5%蚁酸
可用于DNA原位末端缺口标记,而其他脱钙液均不行。

有学者通过对8%硝酸、甲酸-甲醛混合液、20%甲酸液、Jenkins液、10%EDTA 5种脱钙液分别在低温微波15℃组(Ⅰ组)、冰箱4℃(Ⅱ组)、室温20℃(Ⅲ组)和温箱37℃(Ⅳ组)条件下脱钙的对比,免疫组织化学染色、图像分析检测ANP、5-H T 、S-100、NF、GFAP 和Vimentin 的染色。

结果以硝酸作为脱钙剂时,Ⅰ组(1.89+0.97)阳性细胞的光密度
值与Ⅱ组(1.81+1.02)相近,均显著高于Ⅲ(1.03+0.85)、Ⅳ(0.76+0.85)组;脱钙液的温度越高,阳性细胞的光密度值越低,脱钙时间越短。

研究结果证实低温-MW硝酸
脱钙技术能够在较短时间内获得满意的IHCS染色效果[18～20]。

6 骨组织脱钙的注意事项
骨组织脱钙应注意以下几点[1,9,13,18～20]:(1)脱钙时间应根据所用的脱钙剂不同种类;不同的骨组织、骨密质、骨松质和组织块的大小等具体情况而确定脱钙时间。

(2)低温-MW脱钙的关键是保持脱钙液的温度始终控制在15℃以内,尽量减少脱钙液温度过高等人为因素对组织结构、抗原性等的破坏作用。

(3)骨组织取材不宜过厚,一般应在5mm左右,以负脱钙时间过长造成组织形态结构破坏和染色效果不佳。

(4)脱钙容器不能使用金属制品,而且脱钙液的用量要充足,一般为标本的20～30倍,其中更换新液1～2次。

(5)骨组织一般应先固定后脱钙,或脱钙、固定同时进行,未
经骨定的骨组织不宜脱钙,同时脱钙液也不宜加温。

(6)注意脱钙“终点”的鉴定,脱
钙“终点”的鉴定主要有物理检测、X线照相技术和化学检测法。

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