骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析

骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析
Zheng Jie;Fang Qingquan;Tu Jinhua
【摘要】目的探讨骨髓活检组织行EBV encoded RNA(EBER)原位杂交检测的影响因素,优化检测条件以期提高骨髓活检组织中EB病毒的检出率.方法收集35例EB病毒相关疾病的骨髓活检标本,通过对比实验,比较不同脱钙方法、不同蛋白酶K 消化条件、不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的切片质量、脱片率及染色质量情况.结果脱钙以运用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水
冲洗30min～1h最佳;蛋白酶K消化时间为9min的组织切片脱片率低,杂交效果
最好,阳性细胞着色深,定位准确;在37℃条件下进行抗体孵育杂交染色质量为佳.结
论选取合适的脱钙方式,延长蛋白酶K消化时间,选择最佳抗体孵育温度,可降低脱
片率,显著提高骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的染色质量,为EBV相关疾病的诊断和鉴别诊断提供重要依据.
【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》
【年(卷),期】2019(028)002
【总页数】5页(P162-166)
【关键词】骨髓活检组织;EBER;原位杂交;影响因素
【作者】Zheng Jie;Fang Qingquan;Tu Jinhua
【作者单位】;;
【正文语种】中文
【中图分类】R329.3
EBV encoded RNA（EBER）是Epstein-Barr virus（EBV，EB病毒）编码的小RNA，该病毒不仅广泛潜伏于健康人群，而且是一些非肿瘤疾病如传染性单核细胞增多症等的病因。

更重要的是，EB病毒与越来越多的肿瘤性疾病密切相关[1，2]。

EBER原位杂交法因其准确的定位、极高的特异性和灵敏性已成为公认的EB 病毒标准检测方法，并作为病理辅助诊断的重要依据之一在日常工作中应用越来越广泛。

由于原位杂交检测步骤多，容易受各种因素（如组织标本的预处理、标本类型、酶的消化程度、杂交后洗涤等）的影响。

在临床实际工作中对骨髓活检组织行EBER原位杂交检测时，常因组织脱片或者染色结果不稳定需要进行重复实验。

为此，本研究通过实验，从脱钙方法、蛋白酶K消化时间、抗体孵育温度三个影响因素进行优化，摸索较佳的检测条件。

材料与方法
1 标本来源
收集厦门大学附属第一医院病理科2014年5月—2018年5月间确诊为EB病毒相关疾病且标本类型为骨髓活检组织的病例35例。

其中NKT细胞淋巴瘤18例，EBV相关淋巴组织增殖性疾病17例。

所有标本均经l0%中性福尔马林固定不少于6h。

2 设备与试剂
设备：原位杂交仪为Thermo BriteTM公司S500-24 型；
试剂：原位杂交检测试剂盒购自福建泰普公司。

脱钙液的配置：①10%硝酸脱钙液：硝酸10ml加入90 ml蒸馏水；②强酸混合脱钙液配制方法：10%中性福尔马林500ml与95%乙醇500ml混合后，加入甲酸200ml，最后缓慢加入浓盐酸150ml；③ 改良EDTA脱钙液配制方法：250g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶于1350ml磷酸盐缓冲液（PBS），待完全溶解后加入40%甲醛150ml，最后
加入适量氢氧化钠（NaOH），将pH值调到7.0左右[3]。

3 方法
3.1 脱钙方法及脱钙终点的判定
将选取的35例标本每例分为三段，分别放入三种不同的脱钙液室温下进行脱钙：
A组用10%硝酸脱钙液脱钙1～1.5h后取出流水冲洗30min；B组用强酸混合脱
钙液脱钙2-3h后流水冲洗30min；C组用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流
水冲洗30min～1h。

骨髓组织浮起，以尖镊探测骨髓活检组织变软或大头针能轻
松刺入组织视为脱钙完成[4]。

3.2 不同脱钙液脱钙后的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测
①组织脱水与制片：将脱钙完成后的A、B、C三组骨髓活检标本放入自动脱水机
中脱水、透明、浸蜡，包埋。

制片时将组织粘附于APES处理的防脱载玻片，厚度为3μm，60～70℃烤片1h，脱蜡。

②蛋白酶K消化：甩干切片，将组织周围液
体用滤纸擦干，滴加蛋白酶K与PBS按1×25比例配制的酶工作液，室温孵育
5min，蒸馏水洗1×1min。

③杂交:滴加20μl探针/切片，加盖玻片，原位杂交仪55℃变性 60～90min，37℃杂交 4～16h。

48℃ PBS 缓冲液浸泡，移去盖玻片
后PBS继续浸泡洗涤3×5min。

④信号放大和显色: 每张切片分别滴加地高辛染色液试剂A, 37℃孵30min，37℃ PBS浸泡3×2min；试剂B室温孵育30min，PBS浸泡3×2min；试剂C室温30min，PBS浸泡3×2min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。

比较A、B、C三组的脱片率、切片质量、
杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。

3.3 不同蛋白酶K消化时间的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测
将C组用改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片3片，厚度3μm，随机抽取组成D、E、F四组，分别进行5min、9min、13min间隔4min的梯度消化，其余操作步骤同C组，比较D、E、F三组的脱片率、杂交阳性信号的定位与强度、
背景清晰度。

3.4 不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测
将C组改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片2片，厚度3μm，蛋白酶K消化9min后，分两组进行对比实验。

G组：滴加试剂A置于37℃水浴箱孵育30min，滴加试剂B室温孵育20min，滴加试剂C室温孵育 30min；F组：试剂
A孵育30min、试剂B孵育20min、试剂C 孵育30min均在37℃水浴箱中进行，比较G、F两组杂交阳性性号的定位与强度、背景清晰度。

4 EBER原位杂交的判读与染色质量评估标准
细胞核棕黄色为阳性着色，胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有见核分裂时可以出现胞浆阳性着色[5]。

设定组织脱片率、切片质量、杂交阳性信号的位置与强度、
背景是否清晰有无黄染四项为评价指标，评分标准为：①切片质量（100分）：
切片时组织相对较软，基本能完整切片，不影响诊断，减1～10分；切片时感觉
较硬，部分有沙粒感，切片不够平整，不影响诊断，减11～30分；切片时刀片磨损严重，肉眼可见明显刀痕，组织皱缩，无法制成完整切片，影响诊断，减31～100分。

②杂交阳性信号的定位与强度（100分）：阳性信号定位准确，着色较淡，低倍镜下可分辨，不影响诊断，减1～10分；阳性信号定位较准确，着色低
倍镜下不易观察，需转换至高倍镜下仔细辨认，不影响诊断，减11～30分；阳性信号定位不准确，着色太弱，无法准确判读，减31～100分。

③背景清晰度（100分）：阳性与阴性细胞对比鲜明，杂交背景轻微黄染，不影响诊断，减1～10分；阳性与阴性细胞对比度不佳，杂交背景出现不同程度黄染，但仍可作出诊断，减11～31分，杂交背景黄染严重，影响诊断，减31～100分。

由2名经验
丰富的病理医生阅片进行双盲评分，每项指标数据为评分的均值。

5 统计学分析
应用SPSS 22.0 软件进行分析，计数资料采用率的比较，采用χ2 检验，计量资料
采用均数±标准差(¯x±s)表示，用配对t检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响
A、B、C三组切片原位杂交染色质量结果比较见表1。

比较三组脱片率显示，A
组（42.9%）的脱片率明显高于B（14.3%）、C（11.4%）两组的脱片率，差异
有统计学意义（P均＜0.01）。

用三种脱钙液脱钙的骨髓活检组织基本均能完整切片，A组切片时部分会有沙粒感，肉眼可见明显刀痕，B、C两组切片时组织相对
较软，更易切片。

杂交阳性信号定位与强度得分C组均显著高于A、B两组，A组原位杂交染色阳性细胞定位较模糊，信号弱甚至不显示，B组阳性细胞定位准确，可是阳性信号的强度不如C组。

三组背景染色均较清晰，差异无统计学意义。

比
较A、B、C三组原位杂交染色质量（图1）可见用改良EDTA脱钙液脱钙的骨髓
活检标本行原位杂交染色效果最好。

2 不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响
比较D、E、F三组脱片率，F组（42.9%）明显高于D组（8.6%）和E组（14.3%）（P＜0.01）。

D、E、F三组杂交阳性信号的定位与强度得分分别为67.5±2.5、82.5±1.2、81.5±1.0，D 组与 E、F 组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

D、E、F三组背景清晰度指标得分为84.7±1.2、85.3±1.0、62.1±2.4，F组蛋白酶K消化时间长，背景出现不同程度黄染，与D、E组相比差别有统计学意义（P＜0.01）。

比较E、F三组原位杂交染色质量（图2）可见消化时间为
9min组的切片，杂交效果最好，阳性细胞着色深，定位准确，背景干净，结果清晰易辨。

图1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响。

A，A组组织脱片严重，阳性细胞信号不显示；B，B组组织轻微脱片，阳性信号定位准确，信号较弱；C，
C组组织无脱片情况，阳性信号定位准确，阳性信号强；比例尺，50μm。

Fig.1 Effect of different decalci fication methods on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, group A had severe tissue detachment from the slide and no positive cell signal was displayed; B, tissue in group B was slightly detached and the positive signal was accurately located but relatively weak; C, there was no detachment in the tissue sections of group C, and the positive signal was accurately located and strong; scale bar, 50μm
3 不同抗体孵育温度对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响
G、F组杂交阳性信号定位与强度得分分别为79.3±0.8、89.2±0.5，差异有统计学意义（P＜0.01），背景清晰度得分分别为89.2±0.5、82.2±0.5，差别无统计学意义。

因此，试剂A孵育30min、试剂B孵育20min、试剂C 孵育30min均在37℃水浴箱中进行原位杂交检查效果更佳。

表1 不同脱钙方式下的骨髓活检组织原位杂交染色质量评分Tab.1 Quality score of in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues under different decalci fication methods与C组比较：a，0.01＜P＜0.05；b，P＜0.01；n=35Compared to group C: a, 0.01＜P＜0.05; b, P＜0.01; n=35背景清晰度Background de finition Control A 67.8±3.2b 66.5 ±3.0b 78.9±0.9 Control B 79.8±2.2 82.1±1.3a 80.7±1.0 Control C 86.6±1.6 89.4±0.6
82.2±1.2组别Group切片质量Section quality杂交信号定位与强度Hybridization signal localization and intensity
图2 不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响。

A，E组阳性细胞着色深，背景清晰；B，F组背景出现不同程度黄染；比例尺，5μmFig. 2 Effect of different protease K digestion time on the in situ hybridization
staining in bone marrow biopsy tissues. A, the positive cells in group E were deeply stained and accurately positioned with a clear background; B, the background of group F showed different degrees of yellow staining; scale bar, 25μm
讨论
EBER原位杂交检测是在分子水平上用EBER特有序列设计的单链DNA探针与靶
序列按碱基配对原则进行特异性结合,从而检测出EB病毒。

骨髓活检组织结构特殊，富含有大量的无机钙盐，骨组织在制片前必须脱钙去除骨中的钙质，脱钙的同时还要尽量减少骨组织结构的损害及核酸分子的丢失，所以脱钙方式至关重要，脱钙液选择不当会对原位杂交的结果产生极大影响。

10%硝酸脱钙液是目前作为病理工
作中常用的脱钙液，脱钙速度快能力强，但对细胞核和组织结构影响较大，对组织细胞mRNA破坏较大。

强酸混合脱钙液的脱钙能力不及硝酸，对于细胞结构的破坏性以及组织细胞mRNA成分的影响小于硝酸脱钙液，但酸类脱钙液均有脱钙程度不易控制的弱点，脱钙不足难以制片，脱钙过度易导致细胞溶解和组织破坏。

EDTA是一种优良的钙螯合剂，性质温和，能有效的保存细胞结构。

吴鸿雁等[6]
通过对比硝酸、EDTA和新型进口脱钙剂Rapidcal三种不同脱钙液在乳腺癌骨转
移标本的荧光原位杂交（FISH）检测中的表现中发现，硝酸脱钙液处理后的标本
染色效果较差，EDTA脱钙液处理的乳腺癌骨转移标本表现出优秀的标本质量。

但EDTA脱钙时间长（4～6周）极大限制了EDTA脱钙剂的临床应用。

因此本研究
对EDTA脱钙液进行改良，运用了EDTA-2Na并加入40%甲醛固定液，固定脱钙同时进行，原位杂交染色质量得到了明显提高。

除了脱钙方式，酶消化也是原位杂交检测成功与否的关键。

蛋白酶K消化组织的
目的是去除靶核酸周围的蛋白质，增加组织的通透性，暴露靶基因，利于探针渗透，增强杂交信号强度[7,8]。

蛋白酶K消化的关键则是对消化时间的把控。

本研究通
过对比实验发现，延长蛋白酶K消化时间至9min的骨髓切片原位杂交染色效果
最好。

温度是影响抗原抗体结合的重要因素，原则上孵育时间应根据温度的高低进行调整，温度低延长孵育时间，温度高相应缩短孵育时间，但在实际工作中，室温难以调整无法标准化，因此本研究将孵育过程更改成在37℃水浴箱中进行，一定程度上提
高了染色效果。

除了骨髓活检标本脱钙方式、酶消化时间、滴加地高辛染液的温度外，技术员还应重视实验操作过程中的细节，以保证检测结果的准确性。

例如：①滴加蛋白酶K
时应甩干切片，否则蛋白酶被组织上残留的水份稀释，会影响消化的效果；②滴加杂交液后用封片剂进行封边，不但可以防止杂交液挥发也可以节约杂交液的用量；
③用免疫组化油笔圈出抗体滴加范围，防止抗体溢到组织边缘，造成“边缘效应”。

综上所述，通过优化骨髓活检组织的脱钙方式，蛋白酶K消化时间，抗体孵育温
度可显著降低组织的脱片率，提高EBER原位杂交染色质量，使结果稳定性更好，有助于病理医生更准确地进行EBV相关疾病诊断和鉴别诊断。

参考文献
【相关文献】
[1] Zhou Y, Attygalle AD, Chuang S, et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma: histological progression associates with EBV and HHV6B viral load. Br J Haematol, 2007, 138(1):44-53.
[2] Ha SY, Sung J, Ju H, et al. Epstein-Barr virus-positive nodal peripheral T cell lymphomas: Clinicopathologic and gene expression profilin study. Pathol Res Pract, 2013, 209(7):448-454．
[3] 翁丹枫，张声. 改良EDTA脱钙液在骨髓活检组织中染色效果的观察. 临床和实验医学杂志，2018，34（4）：461-462.
[4] 甘启焕，杨清绪. 骨髓活检标本脱钙及除酸方法的改良.诊断病理学杂志，2011，18（2）：151.
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[7] 彭大云，张伟. 改良EBER原位杂交技术在鼻咽肿瘤病理诊断中的应用. 实用医技杂志，2017，24（7）：723-724.
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