谷胱甘肽含量测定

0.1mｏｌ/L磷酸钠溶液缓冲液(pＨ7.7):配制方法见附录。
0.1mol/L(ｐＨ６.８)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。
4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5，5’-dｉthiobis-2-nitｒobｅnoｉc acid，ＤＴNB)溶液:称取1５．8mg DTNB，用0.1mol／L、pＨ6.8磷酸缓冲液溶解,定容至10ml，混匀,4℃保存。现用现配。
另取２支试管,分别加入1mｌ上清液、1ml 0.1mｏl/L磷酸缓冲液(pH7.７)。向一支试管加入０.５ml4mmoｌ/LDTNB溶液,另一支试管中加入0.５ｍl0.1moｌ/L磷酸缓冲液（pH6.8）,将两支试管置于25℃保温１0miｎ。按照制作标准曲线的方法,迅速测定显色液在波长412nm处的吸光度,分别记作ODs和ODｃ。重复3次。
0
2.提取
取材后,称取2.5g样品置于研钵中，加入5mｌ经4℃预冷的50g／L三氯乙酸溶液(含5mmol／L Na2-EDＴA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、１2000g离心20min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。
3.测定
取1支试管,依次加入1ml蒸馏水、1ｍl０.１mol/L磷酸缓冲液（ｐH7.7)和０.5ml 4mmol/L DTNB荣毅仁，混匀,即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比,在波长41２ｎm处对分光光度计进行调零。
项目
试管号
０
1
２
3
4
5
100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ｍl
0
０.2
0．4
0．6
0．8
1．0
蒸馏水/ml
１.0
0.8
０．６
0.4
0．2
0
０.1ｍol／LｐH7.7磷酸缓冲液／ml
1.0
1.0
1.0
１．0
1.0
１.0
4mmol/L DTＮB试剂/ml
0．5
0.５
0．5
0.5
0.５
0.5
相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmoｌ
【计算结果】
显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（ODｓ）和空白对照管反应混合液的吸光度（OＤc）。根据吸光度差值,从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmｏl/g）。
还原型谷胱甘肽含量（μmoｌ/g)=
式中,n为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）;Ｖ为样品提取液总体积(ml）;Vs为吸取样品液体积（ｍl）;m为样品质量（g)。
【注意事项】
１．在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（ＧSSG+ＧＳＨ)和氧化型谷胱甘肽(GSSG）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将ＧSＳG还原成GSH再进行测定和计算。
3.建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照,如果样品中本底对照和空白对照非常接近,则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。
谷胱甘肽含量测定
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植物生理学模块实验指导
李玲主编
科学出版社
还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）
【实验目的】
了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程,学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
【实验原理】
谷胱甘肽是有谷氨酸(Glu）、半胱氨酸(Ｇly)组成的天然三肽,是一种含巯基（—SH)的化合物,广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双－（２-硝基苯甲酸)(5,5’-ｄiｔｈioｂis-2-nitroｂenoic acｉd，DTNB)反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物(GSSG）。2-硝基-5－巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长4１2nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
【器材与试剂】
1.实验仪器与用具
研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（1０0mｌ、２00ml、1０00ｍl）、分光光度计
2.实验试剂
５０g/L三氯乙酸(TCA)溶液（含5mmol/LNａ2-EDTA）:称取5g三氯乙酸,用蒸馏水溶解稀释至100ｍl。再称取１８６ｍgＮa２-EＤTA·2H2Ｏ，加入到100ｍl 50ｇ／L三氯乙酸溶液中溶解。
1０0μmol/Ｌ还原型谷胱甘肽标准液:称取3．1mg还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶【实验步骤】
1.标准曲线制作
取6支试管,编号，按照表1加入各种试剂，混匀,25℃保温反应１0ｍｉn。以0号管为参比调零，测定显色液在4１２nｍ处的吸光度。以吸光度为纵坐标,还原型谷胱甘肽物质的量（μmｏｌ）为横坐标，绘制标准曲线。