(完整版)饲料中霉菌总数测定方法
饲料总菌数的测定
饲料中细菌总数的测定方法标准类别:农业饲料标准实施日期:点击:236本标准参照采用国际标准 ISO4833—1978《食品和动物饲料中微生物学检验方法》。
1 主题内容与适用范围本标准规定了饲料中细菌总数的测定方法。
本标准适用于饲料中细菌总数的测定。
2 原理将试样稀释至适当浓度，用特定的培养基，在30±1℃下培养72±3h，计数平板中长出的菌落数，计算每克试样中的细菌数量。
3 仪器、设备3.1 天平：感量为0.1g。
3.2 振荡器：往复式。
3.3 干热灭菌箱：50-200±1℃。
3.4 高压灭菌锅。
3.5 冰箱：普通冰箱。
3.6 恒温箱30±51℃。
3.7 电炉：可调式。
3.8 平皿：直径为9cm。
3.9 吸管：容量为1、10mL。
3.10 三角烧瓶：容量为 250、500mL。
3.11 玻璃珠。
3.12 试管：18×180mm。
3.13 水浴锅46±1℃。
3.14 酒精灯。
3.15 试管架。
3.16 橡皮乳头。
4 检验程序细菌总数的检验程序如下：检样↓做成几个适当倍数的稀释液↓选择2-3个适宜稀释度，各以1ml量加入灭菌皿内↓每平皿内加入适量琼脂30±1℃↓ 72±3h菌落计数↓报告5 操作步骤5.1 采样采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品混合。
海运进口饲料采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛饲料超过10000t，则应加采一个样品。
饲料中霉菌毒素快速检测技术
Veratox 组胺检测试剂盒
检测线2.5-50ppm
检测结果
NEOGEN公司ELISA试剂盒特点
1-操作简单,速度快-所有的霉菌毒素检测只需移液器和酶标 仪就可以获得准确结果,并且所有试剂盒操作步骤几乎一 样;大部分试剂盒的前期样品处理时间不超过3分钟,检测时 间不超过20分钟,同传统方法相比有明显的优势; 2-使用广泛-世界各地普遍使用,适合于目前中国大多数饲料 企业实验室检测; 3-质量可靠-试剂盒灵敏度和重复性非常高,其它公司产品无 法达到;黄曲霉毒素试剂盒是美国农业部指定使用产品,呕 吐毒素试剂盒是世界同类产品金标准,玉米烯酮试剂盒为 AOAC官方方法;
Veratox 伏马毒素试剂盒
检测线1-6ppm和 50-600ppb
检测结果
Veratox T-2毒素试剂盒
第一步 样品处理 1-取代表性的样品,粉碎,使75%的样品过20目筛; 2-取5g到25ml 50%甲醇溶液中,震荡3分钟; 3-静止2-3分钟,过滤，收集滤液;。 第二步 检测 1-向每个红色微孔中加入100ul酶结合物溶液； 2-再分别加入100ul标准品和样品处理液，混匀； 3-从红色微孔中取100ul到抗体孔中，室温下温育5分钟； 4-洗涤3-5次； 5-每孔加入100ul底物，室温下温育5分钟； 6-每孔加入100ul终止液，混匀； 7-在酶标仪上读数。
Veratox黄曲霉毒素试剂盒 (美国农业部指定使用产品 USDA认证号#2005-102)
Veratox黄曲霉毒素试剂盒 (美国农业部指定使用产品,USDA认证号 #2005-102)
第一步 样品处理 1-取代表性的样品,粉碎,使75%的样品过20目筛; 2-取5g到25ml 70%甲醇溶液中,震荡3分钟; 3-静止2-3分钟,过滤，收集滤液; 第二步 检测 1-向每个红色微孔中加入100ul酶结合物溶液； 2-再分别加入100ul标准品和样品处理液，混匀； 3-从红色微孔中取100ul到抗体孔中，室温下温育2分钟； 4-洗涤3-5次； 5-每孔加入100ul底物，室温下温育3分钟； 6-每孔加入100ul终止液，混匀； 7-在酶标仪上读数
霉菌、酵母检验
霉菌、酵母菌检验（一）实验原理霉菌和酵母菌菌数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g 或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数（粮食样品是指1g粮食表面的霉菌总数）。
（二）实验器材1.培养基：马铃薯－葡萄糖－琼脂培养基马铃薯（去皮切块）300 g葡萄糖20.0 g琼脂20.0 g氯霉素0.1 g蒸馏水1000 mL制法：将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10 min－20 min。
用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL。
加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121 ℃灭菌20 min。
倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。
2.器皿：已灭菌的平皿（9套/组），1mL吸管（6支/组），试管（15×150）（6/组），三角锥瓶500mL、三角锥瓶500mL（内装蒸馏水250mL），10mL吸管。
3.其他：牛皮纸或报纸，酒精灯，棉花，高压蒸汽菌锅，电烘箱，线绳，毛刷等。
（三）操作步骤1.检验程序2.操作要点1）采样选取有代表性的样品并避免采样时的污染。
2）样品处理（1）以无菌操作称取检样25mL，放入含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30 min，即为1:10稀释液。
（2）用灭菌吸量管吸取1:10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL 灭菌吸量管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
（3）取1mL 1:10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸量管吹吸5次，此液为1:100稀释液。
（4）按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸量管。
3）接种培养根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45 ℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25－28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
4）计算方法通常选择菌落数在10－150之间的平皿进行计数，一个稀释度使用两个平板，采用两个平板的平均数；选择稀释度也选择平均菌落数在10－150之间的稀释度，菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母数。
饲料中霉菌毒素检测技术
霉菌毒素是霉菌产生的次级代谢产物
酵母
次
级 代
抗生素
真菌
霉菌
谢
产
物
霉菌毒
素
蕈菌
精品PPT
一、饲料(sìliào)中霉菌毒素的危害
2、霉菌毒素(dú sù)产生的原因
霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、运输 和储存期间生长并产生毒素 农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运输 过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭受霉 菌毒素污染
2、竞争(jìngzhēng) ELISA 的原理
精品PPT
三、ELISA法的操作(cāozuò)要点及注意事项
2、检测(jiǎn cè)步骤及注意事项
（1）准备阶段 • 详细阅读说明书
• 确认试剂盒试剂组成、数量及其用途
• 试剂配制 • 试样的制备、提取及稀释
• 试剂盒试用前要充分回温
• 实验室室温最好控制在20-25℃ • 准备好实验器具（移液枪机及枪头） • 确认仪器设备运行正常
GB/T19540-2004
DB51/T 1080-2010
饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 胶体金法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
取样 GB/T14699.1 2005 饲料 采样
准确、简单、快速有效地检测饲料中的霉（真）菌毒素
July 2011 CHINA FOOD SAFETY 41准确、简单、快速有效地检测饲料中的霉（真）菌毒素□ 拜发分析系统销售（北京）有限公司 供稿分析与检测 ANAlySIS & TEST“当前玉米100%被霉菌污染,90%以上的混合饲料(预混、浓缩、全价)被污染”！在霉（真）菌毒素实用快速检测技术及解决方法讲座上，某企业的负责人语出惊人。
现实如此还是商家在炒作与霉（真）菌毒素相关的产品呢？在对中国13个省的玉米、全价饲料、蛋白饲料等样品进行调查以后，我们发现全价饲料中6种霉（真）菌毒素（黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐霉素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素）检出率均在90%以上。
蛋白质饲料中黄曲霉毒素及玉米样品中呕吐霉素和玉米赤霉烯酮检出率高达100%，且有不同程度的超标。
可见霉菌广泛存在是不争的事实，且霉（真）菌毒素中毒一般是很难解毒的。
美国油脂协会王征用“随处可见”来形容当前饲料行业的霉（真）菌毒素污染程度！在其资料中显示，在配合饲料和饲料原料中玉米和配合饲料的黄曲霉毒素含量高达30μg/kg。
除此之外多种霉（真）菌毒素的共存，混合污染的霉（真）菌毒素的协同作用令其产生更大的破坏力。
因此只有对食品和饲料中霉（真）菌毒素进行定性和定量检测并及时监控——德国拜发R-Biopharm公司试剂盒为美国农业部和欧盟推荐方法和处理，才能保障人畜的健康。
鉴于霉（真）菌毒素独特的结构，寻找快速、高灵敏度、高特异性的霉（真）菌毒素检测方法，显得尤为重要。
德国拜发R-Biopharm公司在2010年正式完成了对美国Trilogy Lab的收购后，成功使得国际上两大霉（真）菌毒素检测领域的研发生产商和服务商（认证实验室）强强结合，在霉（真）菌毒素检测领域，所能提供的产品已毋庸置疑地成为最全面、最专业的代名词。
其中包括美国Trilogy Lab一贯具有国际优势的PuriTox SR 霉（真）菌毒素检测多功能净化柱、Trilogy ®国际认证的霉（真）菌毒素标准品、RIDASCREEN ®霉（真）菌毒素ELISA检测试剂盒、霉（真）菌毒素样品处理装置以及CEN法规唯一规定的霉（真）菌毒素HPLC衍生装置KOBRA CELL等等。
食品微生物霉菌和酵母菌计数检验操作规程
食品微生物霉菌和酵母菌计数检验标准操作程序1 霉菌1.1 试剂：马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基，附加抗菌素、孟加拉红培养基、灭菌蒸馏水1.2 仪器：冰箱、恒温培养箱、均质器、恒温振荡器、显微镜、天平、无菌锥形瓶、无菌广口瓶、无菌吸管、无菌平皿、无菌试管、无菌牛皮纸袋、塑料袋1.3 检验程序1.4 操作：1.4.1 样品的稀释1.4.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1：10的稀释液。
或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2分钟，制成1：10的样品匀液。
1.4.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
1.4.1.3 取1 ml 1：10稀释液注入含有9 ml无菌水的试管中，另换一支1 ml无菌吸管反复吹吸，此液为1：100稀释级。
1.4.1.4 按上述操作顺序制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支1ml无菌吸管，1.4.1.5根据对样品污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内，同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿人空白对照。
1.4.1.6 及时将15-20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平思虑使其混合均匀。
1.4.2 培养1.4.2.1 待琼脂凝固后，倒置于28±1℃温箱培养5天，观察并记录。
1.4.3 菌落计数1.4.3.1肉跟观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌。
以菌落形成单位CFU表示。
1.4.3.2 选取菌落数在10-150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌笔酵母数。
霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。
饲料中霉菌毒素检测技术
紫外检测器 荧光检测器
荧光检测器 荧光检测器 串联质谱 需柱前化学衍生 荧光检测需柱前 化学衍生
甲醇-水
甲醇-水 甲醇-水
免疫亲和柱
免疫亲和柱 免疫亲和柱 SAX净化柱
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
2、免疫亲和柱净化原理
加入待净化样本 洗涤干扰物 洗脱目标物
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
检测方法
高效液相色谱法（荧光） 酶联免疫吸附法 薄层色谱法 液相色谱-串联质谱法 胶体金法 荧光光度法 免疫层析法 高效液相色谱法 高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱法 酶联免疫吸附法 高效液相色谱法 液相色谱-串联质谱法 高效液相色谱法（紫外） 薄层色谱法
高效液相色谱法
黄曲霉毒素
NY/T 2071-2011 NY/T 2550-2014 NY/T 2549-2014 NY/T 2548-2014 DB37/T 2617-2014 GB/T 28716-2012
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
1、HPLC法检测霉菌毒素的关键点比较
霉菌毒素 名称
黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮
提取液
甲醇-水 乙腈-水 水
净化
免疫亲和柱 多功能净化柱 免疫亲和柱 免疫亲和柱
检测器
荧光检测器 串联质谱 荧光检测器 串联质谱
备注
荧光检测需柱前 光化学衍生
脱氧雪腐镰刀菌 烯醇（呕吐毒素） 赭曲霉毒素A
•
•
加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染
拍板用力适当，看不到明显液体为宜
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（5）显色 • • • • 加显色液要快速准确 回形振荡混匀，消除气泡 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内液体挥发，加以密封
饲料霉菌总数的测定国标
饲料霉菌总数的测定国标一、引言饲料是动物生产过程中重要的营养来源。
然而，由于储存条件不当或生产过程中的不洁，饲料可能会受到霉菌污染。
霉菌不仅会降低饲料的品质和营养价值，还可能产生有害的毒素，对动物的健康造成威胁。
因此，为了保证饲料的质量和安全性，饲料霉菌总数的测定国标应当制定和实施。
二、目的和范围本国标的目的在于规定了饲料霉菌总数的测定方法和评价标准，以确保饲料的质量和安全性。
本国标适用于各类饲料样品的霉菌总数测定。
三、术语和定义1. 霉菌总数：指在给定条件下，饲料样品中可生长的霉菌的总数。
2. CFU/g：菌落形成单位/克，表示饲料中每克含有的活菌数量。
四、设备和试剂1. 培养基：按照相关标准配制。
2. 培养皿：直径90-100mm，透明的玻璃或塑料培养皿。
3. 称量仪器：用于准确称量饲料样品。
4. 移液器、均衡培养皿等常规实验室设备。
五、操作步骤1. 取样：从饲料样品中随机取样，确保样品具有代表性。
2. 准备培养基：按照相关标准配制培养基。
3. 加入样品：将取得的样品加入到含有培养基的培养皿中。
4. 均匀涂布：使用均衡培养皿，将样品均匀涂布在培养基上。
5. 培养：将培养皿置于恒温培养箱中，在适当的温度下培养一定时间。
6. 菌落计数：在培养箱中取出培养皿，使用放大镜和计数器进行菌落计数。
7. 记录结果：记录每个培养皿中的菌落数量，并计算平均值。
8. 结果评价：根据国家标准，评价菌落总数是否符合规定的标准要求。
六、结果评价标准根据国家标准，饲料霉菌总数的评价标准如下：1. 优等品：霉菌总数不超过×× CFU/g。
2. 一等品：霉菌总数不超过×× CFU/g。
3. 合格品：霉菌总数不超过×× CFU/g。
4. 不合格品：霉菌总数超过×× CFU/g。
七、注意事项1. 操作过程中要注意无菌操作，避免样品污染。
2. 使用的培养基要符合相关标准，以确保结果的准确性和可比性。
霉菌数的测定
霉菌数的测定
一、供试液的制备
用开空面积为20cm 2的消毒过得采样板压在试样的内层面上，将无菌棉签在无菌生理盐水中稍沾湿，在板孔范围内擦抹5次，换一支再擦5次，共擦抹5个位置100cm 2
,10支棉签，每个棉签擦抹完后将头折断投入盛有30ml 无菌生理盐水的三角烧瓶中。
全部投入后，将烧瓶迅速摇晃1分钟，静置10分钟，即得1:1供试液（原液）。
二、培养基、试剂制备
1、 虎红琼脂培养基
按所需称虎红琼脂干粉，加蒸馏水充分溶解。
经121℃15—20分钟高温灭菌，冷至45℃倾注平皿。
2、 生理盐水
称取0.9g 氯化钠加100ml 蒸馏水，摇匀即可。
溶解分装后于121℃20分钟高温灭菌。
三、检验程序
四、菌落数报告 制备
1:10供试液 1:1000供试液 供试品
1:100供试液
稀释 稀释
2—3个 2—3个
2—3个
注 皿
养
菌落计数 报 告 23—28℃ 72h
1、一般宜选择菌落数在30—100间的稀释级，作为菌落计算的依据。
2、若相邻的2个稀释级的平均平板菌落数处在30—100时，计算级间比值。
当比值≦2时，
以两级菌落数的均值为报告菌数；当比值>2时，按低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
3、各稀释级的平均菌落数均不足30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌
数。
注：报告数值取2位有效数字。
畜禽饲料中霉菌毒素的检测
2018年第7期霉菌毒素具有很多种类,并在自然界中广泛分布,常会污染饲料。
当霉菌污染饲料后就会导致其含有大量的霉菌毒素,从而能够导致畜禽发生中毒死亡,或者导致畜禽的免疫机能降低,长时间处于亚健康状态,生产性能下降,引起免疫失败,并经常发病,还可经由肉、蛋、奶等食物链危害人类健康,实际工作中应该注意采取相应的检测手段。
1主要霉菌毒素饲料、油籽、谷物以及加工的粮食容易污染霉菌,特别是在温度超过25℃,相对湿度达到80%以上时,通风较差以及阴雨季节,更容易污染。
在饲料原料或者饲料中常见的霉菌主要是曲霉菌、镰刀菌和青霉菌。
这些霉菌通常可产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢霉烯(T-2毒素)、呕吐霉素、腐马菌素、串珠镰刀菌素等。
这些霉菌及其产生的毒素常会导致饲料中的常用原料被污染,如曲霉菌分泌的黄曲霉毒素B1(A FB1)、黄曲霉毒素B2(A FB1)、黄曲霉毒素G1(A FG1)以及黄曲霉毒素G2(A FG2),是导致大部分数动物发生霉菌毒素中毒的主要原因;青霉菌属中的多个菌种分泌的赭曲霉毒素,对家禽具有十分强的毒力,且常与黄曲霉毒素一起污染饲料。
每种霉菌或者霉菌毒素基本不会单独存在,常是同时存在2种或者多于2种,多种毒素共同产生的毒性作用会明显大于任何单一毒素产生的毒性,普遍将这种作用称为霉菌毒素的相乘作用。
动物吸收霉菌毒素后会进入血液,并通过血液循环输送到全身各处,甚至是侵入胎盘。
2常用的检测方法在畜禽饲养过程中,如果出现减少采食,饲料结块谷物和饲料发热,颜色变暗,以及散发出较小异味等情况,就可怀疑饲料可能发生霉变。
饲料及其污染霉菌的菌丝体能够纵横交织,编织成菌丝蛛网状物,这种结构导致饲料形成结块。
在肉眼观察发现这些菌丝网状物之前,菌丝体就已经在饲料中大量生长繁殖,由此说明其中已经含有霉菌毒素。
因此,判断饲料发生霉变一种最简易实用的方法就是饲料存在结块。
不同霉菌菌落会形成的特有形态,并具有不同的生物学特征,通过光学显微镜观察能够进一步确认。
饲料中霉菌毒素检测技术共27页文档
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46、寓形宇内复几时，曷不委心任去 留。
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47、采菊东篱下，悠然见南山。
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48、啸傲东轩下，聊复得此生。
Hale Waihona Puke •49、勤学如春起之苗，不见其增，日 有所长 。
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50、环堵萧然，不蔽风日；短褐穿结 ，箪瓢 屡空， 晏如也 。
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！
饲料中霉菌毒素的检测技术
饲料中霉菌毒素的检测技术摘要：饲料被污染后，除了可引起饲料变质外，还可导致动物的各种疾病，甚至引起急性中毒性死亡，给养殖业造成了巨大危害。
论文就霉菌毒素对动物的危害及其在饲料和动物体内的检测方法进行归纳分析，为今后进一步健全霉菌毒素检测方法，减轻霉菌毒素对养殖业的危害提供参考依据。
关键词：饲料；霉菌毒素；检测技术1 霉菌毒素对动物体的危害高浓度霉菌毒素可导致动物的急性中毒甚至死亡，而长期饲喂含有低浓度霉菌毒素的饲料可引起动物体慢性中毒。
其危害主要表现在以下四个方面：（1）破坏或降低饲料的营养成分，影响养分的吸收及代谢；（2）引起动物体肝脏、肾脏、肺脏、肠道等脏器损伤，如黄曲霉毒素的靶器官为肝脏，可引起肝硬化及肝癌等疾病，赭曲霉毒素A、桔青霉素、杂色曲霉毒素具有较强的肾脏毒性，可引起肾小管变性、坏死，导致患畜多尿、血尿及蛋白尿等；（3）引起各种繁殖障碍，导致母畜假发情、脱肛、流产、死胎等，如玉米赤霉烯酮具有较强的激素样作用，可导致动物发情综合症；（4）造成动物体免疫抑制，诱发各类慢性疾病，降低饲料效益。
2 霉菌毒素的检测方法2.1 酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA法是利用抗原抗体反应原理，将已知抗原吸附在酶标板上，加入酶标记抗体和样品提取液并混合均匀，充分反应后用去离子水洗去多余抗体，再加入酶的底物，产生有色物质，最后加入终止液使反应终止，用酶标仪测定酶底物的降解量，参照标准曲线计算试样中的抗原量。
柳其芳采用ELISA法在1-20μg/kg范围内测定黄曲霉毒素B1，CV为0.4%-2.6％，回收率为92%-105％。
Paepens等检测玉米中的烟曲霉毒素含量，检测限为1mg/kg。
ELISA法一般对样品作净化处理，操作简单，检测速度快，成本低，适用于大批量样品的快速筛选。
2.2 近红外光谱法（NIR）NIR法是近年来发展得比较快的光谱分析技术，在农业、食品、化工等多个行业都有成功的应用，创造了良好的社会和经济效益。
饲料中霉菌毒素的检测及控制措施
饲料中霉菌毒素的检测及控制措施作者：李雅丽来源：《现代畜牧科技》2018年第06期摘要：霉菌毒素具有很多种类，并在自然界中广泛分布，往往会污染饲料。
当霉菌污染饲料后就会导致其含有大量的霉菌毒素，从而能够导致畜禽发生中毒死亡，或者导致畜禽的免疫机能降低，长时间处于亚健康状态，生产性能下降，引起免疫失败，并经常发病，还可经由肉、蛋、奶等食物链危害人类健康，应注意检测。
关键词：饲料；霉菌毒素；肉眼观测；显微镜检测；酶联免疫吸附法；荧光检测法；薄层层析法中图分类号：S816文献标识码：B文章编号：2095-9737（2018）06-0052-011 霉菌毒素种类饲料、油籽、谷物以及加工的粮食容易污染霉菌，特别是在温度超过25℃，相对湿度达到80%以上时，通风较差以及阴雨季节，更容易污染。
在饲料原料或者饲料中常见的霉菌主要是曲霉菌、镰刀菌和青霉菌。
这些霉菌通常可产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢霉烯（T- 2毒素）、呕吐霉素、腐马菌素、串珠镰刀菌素等。
这些霉菌及其产生的毒素往往会导致饲料中的常用原料被污染，如曲霉菌分泌的黄曲霉毒素Bl（ AFBl）、黄曲霉毒素B2（ AFBl）、黄曲霉毒素Gl（ AFGl）以及黄曲霉毒素G2（ AFG2），是导致大部分数动物发生霉菌毒素中毒的主要原因；青霉菌属中的多个菌种分泌的赭曲霉毒素，对家禽具有十分强的毒力，且往往与黄曲霉毒素一起污染饲料。
2 常用检测方法肉眼观测。
在畜禽饲养过程中，如果出现减少采食，饲料结块谷物和饲料发热，颜色变暗，以及散发出较小异味等情况，就可怀疑饲料发生霉变。
饲料及其污染霉菌的菌丝体能够纵横交织，编织成菌丝蛛网状物，这种结构导致饲料形成结块。
在肉眼观察发现这些菌丝网状物之前，菌丝体就已经在饲料中大量生长繁殖，由此说明其中已经含有霉菌毒素。
因此判断饲料发生霉变一种最简易实用的方法就是饲料存在结块。
显微镜检测。
不同霉菌菌落会形成的特有形态，并具有不同的生物学特征，通过光学显微镜观察能够进一步确认。
霉菌、酵母菌总数测定(培训用)
检验方法依据 样品状态
按国标右上 角的编号写
固态
样品数量
25g
检验地点 见黑板
检验结果记录
霉菌菌落总数结果记录
稀释度 10-1 10-1 10-2 10-2 10-3 10-3
菌落数 0 0
00
0
0
平均值
0
0
0
培养条件 温度：28℃ ±1 ℃ 时间：5d
实测结果
< 10 CFU/g
本次检验操作共取： 装有灭菌蒸馏水的锥形瓶1只，装有9mL灭
菌蒸馏水的试管3支，空试管1支。 本次检验操作共用：
固体样品：1mL吸量管4支 10mL吸量管1支，
No.xx，有效期：x年x月x日
恒温水浴锅
No.xx，有效期：x年x月x日
恒温培养箱
No.xx，有效期：x年x月x日
灭菌蒸馏水
孟加拉红培养基
注意：
设备编号及计量状态填写应与选用设备相对应。 设备编号及计量状态应按实际情况填写，内容为设备上的绿 色合格证。
实验记录
样品名称 样品编号
按试题单上 填写
3.6 ×103 CFU/g
标准值 查看“产品标准值”表，填写
单项检验结论
符合（或不符合）
备注
检验人员：填写准考证号
检验日期：填写考试当天日期
关于实测结果的填写
若所有稀释度平板上的菌落数都为“0”，则实测结果为 ＜1×最低稀释倍数计算。
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内 （10~150CFU），计算两个平板菌落数的平均值，再将 平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克中菌落总数结果。
标准值 查看“产品标准值”表，填写
饲料中霉菌毒素的检测与控制
李秋玫阮静（天津正大饲料科技有限公司）1 霉菌毒素的特点及检测方法霉菌毒素是真菌的次级代谢产物，真菌代谢产物中的有毒物质统称为霉菌毒素。
1960年英国“火鸡X病”爆发，世界开始注重对霉菌毒素中毒的彻底调查，现已知有300多种真菌可产生毒素。
火鸡X -病的重要特征是，感染的动物不仅仅会受到黄曲毒素中毒的伤害，更常会继发其他多种病原感染，如沙门氏菌和大肠杆菌，这些继发感染常使症状显得更加复杂，从而导致诊断上的失误或延误。
现在已取得的共识是，由不同的霉菌毒素造成的中毒会导致动物免疫功能受到抑制，从而使动物对传染病病原的易感性增加，甚至一些对健康动物不具感染力的病原也会因霉菌毒素中毒而使动物发病。
另外，轻度霉菌毒素污染的饲料其营养价值也会遭到破坏，饲料适口性明显下降，对动物的健康产生潜在的威胁。
Ba rtov等（1982）发现发霉玉米及高梁所含脂肪量显著减少。
谷物、油籽、加工的粮食及饲料容易受到霉菌的污染，尤其是在温度高于25℃、相对湿度大于80%时以及通风不良和阴雨季节（图1）。
在饲料或饲料原料中生长的霉菌可以分成3属：曲霉菌（Asp ergillus）、青霉菌（Penicillium）和镰刀菌（Fusarium）。
这些霉菌产生常见的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素，以及属于镰刀菌毒素的呕吐霉素、单端孢霉烯（T-2毒素）、玉米赤霉烯酮、串珠镰刀菌素、腐马菌素等。
这些霉菌及其产生的毒素常常污染饲料中的常用原料，例如由曲霉菌产生的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2，与大多数动物的霉菌毒素中毒有关；而青霉菌属中的多个菌种会产生赭曲霉毒素（Ochratoxin），他对家禽具有很强的毒力，且常和黄曲霉毒素共同污染饲料。
通常我们关注的都是黄曲霉毒素，但是研究发现，镰刀菌毒素也不容忽视。
Russell 等（1991）调查了美国82家饲料厂，发现玉米平均含霉菌孢子数为2.63×104个/g，以镰刀霉菌属最为常见。
饲料中霉菌毒素检测技术PPT课件
霉菌
பைடு நூலகம்
代 谢
产
物
霉菌毒
素
蕈菌
.
3
一、饲料中霉菌毒素的危害
2、霉菌毒素产生的原因
霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、 运输和储存期间生长并产生毒素
农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运 输过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭 受霉菌毒素污染
.
4
一、饲料中霉菌毒素的危害
3、霉菌毒素的种类
现已报道的霉菌毒素大约有300种
在饲料中常见的、对人和动物健康造成潜在 危害的毒素主要有：黄曲霉毒素、玉米赤霉 烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素和脱 氧雪腐镰刀菌稀醇（呕吐毒素）等6种毒素
.
5
一、饲料中霉菌毒素的危害
4、霉菌毒素的主要危害
一是可以引起饲料的变质，产生异味，降低 其饲用价值，甚至完全让其失去商品价值
二是饲料被霉菌污染后，导致畜禽的急、慢 性中毒，免疫机能和生产性能下降，造成养 殖业效益的下降
4、检测方案
初筛
胶体金
ELISA
批量样本
可疑样品
阳性样确证
√液
高
荧
质
效
光
联
液
分
.
用
相
析
10
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
5、检测流程
取样 GB/T14699.1 2005 饲料 采样
制样 GB/T20195 动物饲料试样的制备
萃取
净化（主要用于色谱法）
分析测试
.
11
三、ELISA法的操作要点及注意事项
.
8
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
3、主要检测方法的特点比较
饲料微生物检验原始记录
饲料微生物检验原始记录样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：检测依据：一、菌落总数、霉菌总数以无菌操作称（量）取样品25g（或10g）,加入225ml（或90ml）的无菌生理盐水中，均质后，做成1∶10样品液。
取1∶10稀释液1ml加入到9ml生理盐水中，混匀，做成1∶100样品均液。
以上法制备10倍系列稀释样品均液。
选择2-3个适宜稀释度的样品均液，吸取1ml样品均液于无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照，及时将15-20ml 冷至46℃的营养琼脂培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀，凝固后，可在培养基表面倾注冷至46℃的水琼脂培养基4ml, 凝固后翻转平板，置 30±1℃培养小时，计数平板上菌落数（CFU）。
霉菌计算及结果：细菌菌落数（CFU/g,ml）：霉菌菌落数（CFU/g,ml）：二、大肠菌群测定：按菌落总数测定方法制备lO0、10-1、10-2、10-3、10-4……稀释液。
选择3个适宜的连续稀释度的样品均液，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管，每管接种1ml（接种量超过1ml，则用双料乳糖胆盐发酵管），36±1℃培养24±2h，观察倒管内是否有气泡产生，对于24±2h产气者，用接种环从产气的乳糖胆盐发酵管中分别取培养物一环，分别转种到在伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18h～24h，观察菌落形态，并做确证实验。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性。
注：○+产酸产气；+产酸不产气或有可疑菌落；-不产酸不产气或无可疑菌落；G-b革兰氏阴性杆菌；G+b革兰氏阳性杆菌；G+c革兰氏阳性球菌。
结果：根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，得 MPN/100g(mL)。
电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：三、产气荚膜梭菌以无菌操作称取样品25g（ml）加入225ml蛋白胨生理盐水稀释液，均质后，做成1∶10稀释液。
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霉菌总数检测操作规程
1 原理
根据霉菌生理特性，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平板计数法测定霉菌总数。
2 试剂与仪器
2.1 所用器具
三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器
2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅
2.3 所用试剂和培养基
高盐察氏培养基
取高盐察氏培养基109g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌30 min，备用。
3、操作步骤
3.1配制0.85%生理盐水
称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。
3.2 锥形瓶加入生理盐水90mL，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。
（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）。
3.3 将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺、带6颗玻璃珠具塞试管，121℃灭菌30min。
（注意计算数量）
3.4 枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。
（1-3步需提前一天完成）
3.5 对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。
以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。
3.6 吸取1:10稀释液10mL注入带玻璃珠的试管，置微型混合器上混合3min。
3.7 用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。
3.8 另取一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一
次，更换一支灭菌吸头。
3.9 选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。
3.10 稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的高盐察氏培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀。
3.11 待琼脂凝固后，倒置平皿于28℃±1℃恒温培养箱内培养3天后开始观察，培养观察一周。
计算平板内菌落总数目，菌落总数乘以稀释倍数，即得每克试样所含霉菌总数。
4 霉菌总数计算方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观察，如菌落形态较小可借助放大镜观察。
在计算出各平板菌落总数后，求出同稀释度的两个平板菌落的平均值。
4.1 霉菌总数的报告形式
菌落总数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数表示。
（见表1）
4.2霉菌总数计数的报告
4.2.1 平板霉菌总数的选择
选择菌落总数在10~100之间的平板进行霉菌总数测定，每一稀释度使用两个平板菌落的平均数。
两个平板其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全平皿霉菌总数。
4.2.2 稀释度的选择
①应选择平均菌落总数在10~100之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例次1）
②若有两个稀释度，其生长的菌落总数均在10~100之间，则视两者之比如何来决定。
若其比值（高稀释度数值：低稀释度数值）≤2，应报告其平均值；若＞2则报告其中较小的数字（见表1中例次2及例次3）。
③若所有稀释度的平均菌落总数均大于100，则应按稀释度最高的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次4）。
④若所有稀释度的平均菌落总数均小于10，则应按稀释度最低的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次5）。
⑤若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释度报告之（见表1中例次6）。
⑥若所有稀释度的平均菌落总数均不在10~100之间，其中一部分＞100，或者小于10时，则以最接近10或100的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次7）。
例次稀释液及菌落总数稀释液
之比
稀释度选择
霉菌总数
/[CFU/g（mL）]
报告方式
/[CFU/g（mL）] 10-110-210-3
1 多不
可计
80 8 —
取平均菌落总数在10~100之间
的稀释度
8000 8.0×103
2 多不
可计
87 12 1.4
10~100之间，比值（12000：8700）
≤2，报告平均值
10350 1.0×104
3 多不
可计
95 20 2.1
10~100之间，比值（20000：9500）
＞2，报告较小的数值
9500 9.5×103
4 多不
可计
多不
可计
110 —
所有稀释度的平均菌落总数均
大于100，报告稀释度最高的数
110000 1.1×105
5 9 2 0 —所有稀释度的平均菌落总数均
小于10，报告稀释度最低的数
90 90
6 0 0 0 —所有稀释度均无菌落生长，则以
＜1乘以最低稀释度
＜1×10＜10
7 多不
可计
102 3 —
所有稀释度的平均菌落总数均
不在10~100之间，报告最接近
10或100的数
10200 1.0×104注：CFU/g（mL）与个/g（mL）相当。