(完整版)饲料中霉菌总数测定方法

霉菌总数检测操作规程

1 原理

根据霉菌生理特性，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平板计数法测定霉菌总数。

2 试剂与仪器

2.1 所用器具

三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器

2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅

2.3 所用试剂和培养基

高盐察氏培养基

取高盐察氏培养基109g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌30 min，备用。

3、操作步骤

3.1配制0.85%生理盐水

称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。

3.2 锥形瓶加入生理盐水90mL，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）。

3.3 将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺、带6颗玻璃珠具塞试管，121℃灭菌30min。（注意计算数量）

3.4 枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成）

3.5 对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。

3.6 吸取1:10稀释液10mL注入带玻璃珠的试管，置微型混合器上混合3min。

3.7 用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。

3.8 另取一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一

次，更换一支灭菌吸头。

3.9 选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。

3.10 稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的高盐察氏培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀。

3.11 待琼脂凝固后，倒置平皿于28℃±1℃恒温培养箱内培养3天后开始观察，培养观察一周。计算平板内菌落总数目，菌落总数乘以稀释倍数，即得每克试样所含霉菌总数。

4 霉菌总数计算方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观察，如菌落形态较小可借助放大镜观察。在计算出各平板菌落总数后，求出同稀释度的两个平板菌落的平均值。

4.1 霉菌总数的报告形式

菌落总数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数表示。（见表1）

4.2霉菌总数计数的报告

4.2.1 平板霉菌总数的选择

选择菌落总数在10~100之间的平板进行霉菌总数测定，每一稀释度使用两个平板菌落的平均数。两个平板其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全平皿霉菌总数。

4.2.2 稀释度的选择

①应选择平均菌落总数在10~100之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例次1）

②若有两个稀释度，其生长的菌落总数均在10~100之间，则视两者之比如何来决定。若其比值（高稀释度数值：低稀释度数值）≤2，应报告其平均值；若＞2则报告其中较小的数字（见表1中例次2及例次3）。

③若所有稀释度的平均菌落总数均大于100，则应按稀释度最高的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次4）。

④若所有稀释度的平均菌落总数均小于10，则应按稀释度最低的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次5）。

⑤若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释度报告之（见表1中例次6）。

⑥若所有稀释度的平均菌落总数均不在10~100之间，其中一部分＞100，或者小于10时，则以最接近10或100的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次7）。

例次稀释液及菌落总数稀释液

之比

稀释度选择

霉菌总数

/[CFU/g（mL）]

报告方式

/[CFU/g（mL）] 10-110-210-3

1 多不

可计

80 8 —

取平均菌落总数在10~100之间

的稀释度

8000 8.0×103

2 多不

可计

87 12 1.4

10~100之间，比值（12000：8700）

≤2，报告平均值

10350 1.0×104

3 多不

可计

95 20 2.1

10~100之间，比值（20000：9500）

＞2，报告较小的数值

9500 9.5×103

4 多不

可计

多不

可计

110 —

所有稀释度的平均菌落总数均

大于100，报告稀释度最高的数

110000 1.1×105

5 9 2 0 —所有稀释度的平均菌落总数均

小于10，报告稀释度最低的数

90 90

6 0 0 0 —所有稀释度均无菌落生长，则以

＜1乘以最低稀释度

＜1×10＜10

7 多不

可计

102 3 —

所有稀释度的平均菌落总数均

不在10~100之间，报告最接近

10或100的数

10200 1.0×104注：CFU/g（mL）与个/g（mL）相当