细菌和霉菌总数的检验

生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的微生物总数。
3.2仪器
3.2.1250ml锥形瓶。
3.2.2电子天平、量筒。
3.2.3压力蒸汽灭菌锅。
3.2.4移液管。
3.2.5灭菌培养皿：直径9cm。
3.2.6酒精灯。
3.2.7恒温培养箱。
3.2.8放大镜。
3.3培养基和试剂的制备
3.3.1生理盐水：氯化钠8.5g
细菌计数结果及报告方法：
例次
不同稀释度的平均菌落数10-110-210-3
两稀释度菌数之比
菌落总数
个/g或个/ml
报告方式
个/g或个/ml
1
1365 16பைடு நூலகம் 20
－
16400
16000或1.6×104
2
2760 296 46
1.6
38000
38000或3.8×104
3
2890 271 60
2.2
27100
60÷2×63.6×1000＝1.9×106
63.6是按皿底直径为9cm时计算而得的面积，如所用培养皿底直径不是9cm，应另求面积。
4）鉴于检样中的细菌是以单个、成双、链状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可
以来源于细胞块，也可来源于单个细胞，故平板上所得需氧和兼性厌氧的菌落数应以单位重量（g）或容量（ml）的菌落形成单位（Colony Formingunits CFU）报告更恰当。
2）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细胞
块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如培养皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。
制订/修订
审核
批准
实施日期
分发号
27000或2.7×104
4
不可计4650 513
-
513000
510000或5.1×105
5
27 11 5
-
270
270或2.7×102
6
不可计305 12
-
30500
31000或3.1×104
7注解：
7.1操作注意事项：
1）尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。
5菌落计数方法：
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各培养皿的菌落数后，求出同一稀释度各培养皿生长的平均菌落数；若培养皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该培养皿不宜计数；若片状菌落不到培养皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个培养皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。
4.1.1细菌总数检测：用移液管吸取1：10稀释的检样1ml，注入到一个灭菌培养皿内；将熔化并冷至45～50℃的卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基倾注于培养皿内，每皿约15ml；随即水平转动培养皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转培养皿，置37℃培养箱内培养48h。
4.1.2霉菌总数检测：用移液管吸取1:10稀释的检样1ml，注入到一个灭菌培养皿内；将熔化并冷至45～50℃的虎红琼脂培养基倾注于培养皿内，每皿约15ml；随即水平转动培养皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转培养皿，置25℃培养箱内培养72h。
3.1方法提要：
本标准采用标准平板计数法。化妆品中污染的微生物种类不同，每种微生物都有它一定
的生理物理特性，培养时对营养要求、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。
在实际工作中，不可能做到满足所有菌种的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使
用的条件下（在卵磷脂、吐温-80营养琼脂上，于37℃培养48h；在虎红琼脂培养基上培养72h)
6.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。
6.4若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例5)。
6.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例6)。
6菌落计数原则及报告方法：
6.1首先选取平均菌落数在30～300之间的培养皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释
度的平均菌落数符合此范围时，即以该培养皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例１）
6.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。
若其比值小于或等于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数(见表中例2例3)。
3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而应在稀释最大的平板上，任意数其中
两个平方厘米中的菌落数，除以2求出lcm2内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘以其稀释倍数。以此结果作报告，例如：10-1～10-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每克（或ml）中“估计”菌落数为：
蒸馏水1000ml
溶解后，分装到加适量玻璃珠的250ml锥形瓶内，每瓶90ml，经121℃(0.11 MPa)20min高温高压灭菌。
3.3.2卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基：
制法：称取51g粉状卵磷脂、吐温80-营养琼脂成品培养基加入到1000ml纯水中混合,溶解均匀后分装,经121℃(0.11 MPa)20min高温高压灭菌，储存于冷暗处备用。
本标准规定了化妆品微生物学细菌和霉菌总数的检验。
本标准适用于化妆品细菌和霉菌总数的检测。
GB 7916化妆品卫生标准
GB/T 7918化妆品微生物标准检验方法
QB/T 1684-1993化妆品检验规则
细菌总数是指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。测定细菌总数和霉菌总数可用来判明化妆品被微生物污染的程度，以及生产所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
6.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。
6.7菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见下表报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
3.3.3虎红琼脂培养基：
制法：称取31.6g粉状虎红琼脂成品培养基加入到1000ml纯水中混合,溶解均匀后分装,经121℃(0.11 MPa)20min高温高压灭菌，储存于冷暗处备用。
4倒培养皿操作步骤：
4.1按国家标准要求检测细菌总数和霉菌总数.
倒培养皿前供检样品的采集、保存和样品制备按《微生物检验总则》要求进行操作。
2）制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。
3）注意抑菌现象，由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少，而高释释度时菌落数反而增大。
4）对照试验。化妆品的稀释液（特别是1:1O的稀释液）常带有化妆品颗粒，有时与菌落很难区分，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到4℃环境中，以便计数检样菌落时用作对照。
5）另一种防止化妆品颗粒与菌落混淆的方法是培养基中加TTC。
注：TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。
TTC溶液在使用前应在水浴中煮沸半小时。
7.3菌落计数及报告注意事项
1）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工
作中发生差错；二是受防腐剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。