碱裂解提取质粒各个试剂作用
质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。
质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。
关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。
一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
各种试验中试剂的成分和作用
一、碱裂解法提质粒：2、每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I 中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4M的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4M的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS(?)，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
质粒提取 纯化试剂
质粒提取纯化试剂
质粒提取是一种从细菌中提取和纯化质粒（即小圆环状的DNA分子）的过程。
在质粒提取过程中，需要使用一系列纯化试剂来帮助分离和纯化质粒DNA。
以下是一些常用的质粒提取纯化试剂：
1. 碱裂解试剂：用于打断细菌细胞壁和细胞膜，释放内部DNA。
常见的碱裂解试剂包括盐酸（HCl）和EDTA（乙二胺四乙酸）。
2. 酚/氯仿：用于提取DNA和脂质等有机物质，并分离DNA 与其他细胞组分。
酚/氯仿会形成两相体系，DNA会在上层的水相中。
3. 氯化物：如氯化钠（NaCl）和氯化钙（CaCl2），用于增加DNA在水相中的溶解度，改善DNA的纯化。
4. 醇：如乙醇和异丙醇，用于沉淀DNA。
通过加入醇，DNA 会在醇和水的接触界面处形成团状物质，沉淀出来。
5. 洗涤缓冲液：用于洗涤DNA颗粒，去除杂质和剩余的试剂残留。
常见的洗涤缓冲液包括醇洗涤缓冲液（含乙醇）和盐洗涤缓冲液（含盐）。
6. Elution缓冲液：用于将DNA从固相材料（如硅胶柱、离心管滤膜等）上洗脱下来，使其溶解在溶液中。
常见的Elution 缓冲液包括纯水、低盐缓冲液、TE缓冲液等。
这些试剂在质粒提取纯化过程中起着重要的作用，帮助分离和纯化质粒DNA，并去除杂质和其他细胞组分。
不同的实验室和研究目的可能会选择不同的试剂和纯化方法。
质粒提取总结
碱裂解法抽提质粒原理溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH ；（溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染）溶液II， N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M醋酸钾 / 2 M醋酸。
溶液I的作用：①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II：这是用新鲜的 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测一、实验目的与原理简介实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。
质粒作为载体应具备下列四个特点:①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。
②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等)。
④拷贝数多,易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA.实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的.在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。
实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。
二．实验试剂1,SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2。
5ml,0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20％葡萄糖4。
5ml( 葡萄糖单独灭,灭完后加入Sol I中），高压灭菌，4°保存.2,SolⅡ100ml:（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml, 2M NaOH 50ml.使用前将两种溶液混合。
3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57。
5ml，加300mlDDW搅拌,定容至500ml。
高压灭菌，4°保存。
4，70%乙醇无菌水DDW5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24:1)氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
质粒DNA的提取碱裂解法
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
质粒碱裂法中醋酸铵加无水乙醇的作用
质粒碱裂法中醋酸铵加无水乙醇的作用全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：质粒碱裂法是生物学实验中常用的一种方法，用于提取DNA质粒以及其他细胞成分。
在进行质粒碱裂法时，通常会添加一定浓度的醋酸铵和无水乙醇，这两种试剂在质粒提取过程中起着重要的作用。
醋酸铵是一种常用的DNA沉淀试剂，在质粒碱裂法中添加醋酸铵的目的是沉淀DNA质粒以及其他细胞成分。
醋酸铵可以与DNA形成沉淀，使DNA质粒从细胞的其他成分中分离出来。
醋酸铵还可以改变DNA的溶解性，帮助提取DNA质粒时更容易分离DNA和其他细胞成分。
无水乙醇在质粒碱裂法中主要起到沉淀DNA的作用。
当无水乙醇加入到含有DNA的混合物中时，会使DNA沉淀到混合物的底部，方便后续的离心分离和提取。
无水乙醇还可以帮助分离DNA和其他细胞成分，提高DNA质粒的纯度。
在进行质粒碱裂法时，醋酸铵和无水乙醇的加入需要注意合适的浓度和操作条件，以保证实验的准确性和精确性。
在实验过程中，需要根据实际情况调整醋酸铵和无水乙醇的浓度，控制好反应的时间和温度，以达到最好的分离效果。
醋酸铵和无水乙醇在质粒碱裂法中扮演着重要的角色，帮助提取DNA质粒并分离DNA与其他细胞成分。
合理使用这两种试剂能够提高实验效率和准确性，为后续的实验和研究奠定基础。
【这篇文章共计356字】接下来我们继续深入讨论醋酸铵和无水乙醇在质粒碱裂法中的作用，从分子水平上解释它们如何影响DNA提取的效果。
首先来看醋酸铵的作用。
醋酸铵是一种阳离子试剂，其阳离子NH4+能与DNA的磷酸根结合，从而中和DNA的负电荷，使DNA成为中性物质。
这样一来，DNA分子之间的静电排斥力减弱，有利于DNA分子聚集形成较大的沉淀颗粒。
醋酸根离子(C2H3O2-)也可以与DNA形成亲缘性较弱的配合物，有助于DNA的沉淀。
除了上述作用，醋酸铵还可以降低水的活性，使得水的极性减弱，有利于DNA与水间的疏水作用，从而促进DNA的离心沉淀。
碱裂解法抽提质粒的原理
碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。
溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。
因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。
乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
注意不要振荡。
将离心管放置于冰上5分钟。
注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。
质粒DNA的提取(碱裂解法)
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法
一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法碱裂解法是一种常用的提取细菌质粒的方法，其中使用碱溶液将细菌细胞膜破坏，释放出质粒。
以下是一种常见的碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法。
试剂盒：1.细菌培养液：包括选用适当的培养基和细菌株。
2. 细菌裂解缓冲液：含有Tris-HCl缓冲液和EDTA。
3.10%SDS溶液：用于破坏膜结构。
4.高浓度盐溶液：如5MNaCl。
5.中度浓度盐溶液：如3MNaAc。
6.古登染色液：用于沉淀蛋白质。
7.对冷酮糖溶液：用于沉淀核酸。
方法：1.培养细菌：选择所需的细菌株并在适当的培养基中培养。
2.扩大培养：将培养的细菌转移到大容量的培养基中，并继续培养至细菌密度达到所需的浓度。
3.采集细菌：将培养液用离心机离心，收集菌体沉淀。
4.裂解细菌细胞：将菌体沉淀重悬于适量的细菌裂解缓冲液中，加入适量的10%SDS溶液，轻轻混合。
5.离心：离心裂解细胞混合物以分离出细胞碎片。
6.中度盐沉淀：将离心上清液过滤，并用中度浓度盐溶液沉淀DNA。
7.脱盐：用绝对醇洗涤被沉淀的DNA以去除盐类。
8.溶解DNA：用适量的对冷酮糖溶解DNA。
9.抽提：将DNA溶液抽提至无水醇中，用于下一步的分析和应用。
这种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及方法简单易行，可以实现较高的质粒提取效率。
其优点包括：1.成本低廉：试剂盒中的试剂易于获取，成本较低。
2.操作简便：方法步骤清晰简单，不需要复杂的仪器设备。
3.提取效率高：经过适当的操作，可以获得高质量和高浓度的细菌质粒。
然而1.严格控制操作条件：提取细菌质粒时，必须严格控制操作条件，避免RNA、蛋白质等污染物的混入。
2.适当改进方法：根据实验要求，可以适当改进方法，如增加裂解步骤的酶解时间、调整试剂浓度等，以提高提取效率。
3.注意DNA保存：提取的细菌质粒应妥善保存，避免降解和污染。
总而言之，这种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法是一种常用且简单易行的方法，适用于各种分子生物学实验和应用。
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
碱裂解提取质粒的关键：选择合适的试剂
碱裂解提取质粒的关键：选择合适的试剂
碱裂解提取质粒时，选择合适的试剂至关重要。
以下是一些关键指导原则，以确保提取过程的成功和质粒DNA的完整性：
1. 溶液I：
选择含有葡萄糖、EDTA和Tris-HCl的溶液I，这些成分分别用于保护DNA、螯合金属离子和维持pH稳定。
2. 溶液II：
选择高浓度的NaOH和SDS，这些试剂能有效地破坏细胞膜，释放质粒DNA。
3. 溶液III：
选择醋酸钾和高浓度盐溶液，以确保质粒DNA的有效沉淀和分离。
4. SDS（十二烷基硫酸钠）：
选择纯度高的SDS，以确保其有效地破坏细胞膜和释放DNA。
5. RNase：
选用质量好的RNase，以防止RNA在提取过程中对DNA的干扰。
6. 酚/氯仿：
选择有机溶剂酚和氯仿，用于去除蛋白质和其他杂质，提高DNA纯度。
7. 乙醇：
选择无水乙醇或高纯度乙醇，以确保DNA的有效沉淀。
8. 70%乙醇：
用于洗涤DNA，去除残留盐分和其他杂质。
选择纯度高的乙醇进行配制。
在选择试剂时，还需考虑其品牌、保质期、纯度和使用安全性等因素。
建议使用经过验证和评价的试剂，遵循厂家推荐的使用说明。
此外，要定期对试剂进行质量检查，以确保其性能和可靠性。
总之，选择合适的试剂是碱裂解提取质粒成功的关键之一。
通过仔细评估和选择高质量的试剂，可以确保提取过程的顺利进行和质粒DNA的高质量提取。
碱裂解法提取质粒实验报告
一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。
2. 熟悉实验过程中所使用的仪器和试剂。
3. 学习质粒DNA的纯化和检测方法。
二、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法，其原理基于质粒DNA与染色体DNA在变性和复性过程中的差异。
在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
而质粒DNA由于具有共价闭合环状结构，其氢键断裂后，两条互补链仍保持一定程度的结合。
当pH值调节至中性时，质粒DNA能够迅速复性，而染色体DNA则不能复性，形成缠连的网状结构。
通过离心，可以将复性的质粒DNA与未复性的染色体DNA及其他杂质分离开。
三、实验材料1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量离心管、移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。
2. 试剂：LB液体培养基、含质粒的大肠杆菌、溶液I（50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mg/mL溶菌酶）、溶液II（200 mmol/L NaOH、1% SDS）、溶液III（3 mol/L NaAc，pH 4.8）、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA）、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、溴化乙锭（EB）等。
四、实验步骤1. 将含质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。
2. 取适量菌液，8000 rpm离心2分钟，收集菌体。
3. 将菌体沉淀用溶液I重悬，加入溶菌酶溶液，室温放置10分钟。
4. 加入溶液II，混匀，65℃水浴10分钟。
5. 加入溶液III，混匀，室温放置5分钟。
6. 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。
7. 向上清液中加入等体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。
8. 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。
9. 用70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。
10. 弃去洗涤液，将沉淀溶解于TE缓冲液中。
掌握碱裂解法抽提质粒的原理
6.中和： 加350ul溶液P3 ，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时将出现白色 絮状沉淀。（注：此时质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀）。
↓10000 rpm, 10 min
7.转移上清：将上清吸入另一支干净的离心管中（注意尽量不要吸出沉淀）
↓10000 rpm, 10 min
2. 柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上 ↓ 10000 rpm，1min
倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上
3. 收集菌体： 取1.4ml菌液转入小离心管中
↓ 10000 rpm，1min
弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。
4.悬浮： 加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底
实验仪器与材料
（一）仪器：超净工作台， 恒温摇床，台式离心机， 高压灭菌锅
（二）材料：1.5ml 离心管， 加样枪，含有质粒pQE30 的大肠杆菌TG1 、LB液 体培养基
实验步骤
1. 细菌培养：接种含质粒pQE30的大肠杆菌TG1 10μl 到10ml含氨苄青霉素 (100μg /ml)的LB培养液中， 37℃摇培过夜（10~12h）
▪ 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 ▪ TE缓冲液：溶解DNA
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液（含DNA)
TE溶解DNA
溶液I充分重悬 溶液II裂解
酚抽提(去蛋白）
质粒DNA溶液
乙醇沉淀DNA
溶液III中和
洗涤沉淀
[质粒提取试剂盒组成]
平衡液BL STE缓冲液（溶液P1） Lysis Buffer（溶液P2） 3M NaAc，pH 4.8（溶液P3） 去蛋白液PD 漂洗液PW 洗脱缓冲液EB 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA （10mg/ml）
碱裂解法提取质粒三种溶液的作用
碱裂解法提取质粒三种溶液的作用
溶液Ⅰ：葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNaseA 消化RNA。
溶液Ⅱ
此步为碱处理。
其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。
SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS 作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；
第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。
溶液Ⅲ
溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。
其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。
因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。
2M的醋酸是为了中和NaOH。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA 条带。
75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。
质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用(强碱裂解法)
质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用
一溶液Ⅰ（P1）
组分浓度25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡萄糖（Glucose）
白质稳定性很差，所以加了RNase A的溶液Ⅰ需要低温4℃保存。
二溶液Ⅱ（P2）
备注：（1）时间一定不能过长；（2）不可以剧烈震动离心管。
时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA，断裂的基因组DNA碎片将会与相似大小质粒一同被抽提，污染样品。
三溶液Ⅲ（N3）
备注：（1）强碱溶液氢氧化钠长时间与DNA接触会破坏其结构，因此需要进行中和。
四溶液PE （wash buffer）
组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5），80 %乙醇（Ethanol）
备注：试剂盒中都是利用硅胶柱进行DNA提取的。
在DNA与硅胶柱吸附后，需要利用Wash buffer清洗掉多余的盐离子。
Wash buffer中含有高浓度的乙醇，由于乙醇会影响后续的酶切或测序反应，在洗脱DNA前必须要在离心机内”空甩”柱子，完全清除掉乙醇。
五溶液EB（Elution buffer）
子会打破硅胶负氧根和水之间的氢键，使得整体的硅胶携带正电，会吸引携带负电的DNA 分子。
（2）加热过的洗脱液（<50°C）可以加速DNA从硅胶膜上脱离下来
（3）离心前保持EB缓冲液在膜上停留时间长一些，将更有利于DNA的洗脱。
不同公司的质粒提取试剂盒中溶液成分可能有所差异。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
质粒提取试剂的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。
追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。
这是导致我的学生误入歧途的主要原因。
后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。
这就不得不让人感到悲哀了。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：
溶液I：50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II：0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III： 3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I 中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质
粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。
每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS 溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白
质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。
酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA 会干扰电泳结果的。
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不
要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。
这里暂不深究。