枯草芽孢杆菌对禽舍分离致病菌的抑菌作用研究

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试验动物:1~3 日龄雏鸡,购自沈阳农业大学畜牧
基金项目:沈阳农业大学大学生科技创新项目“枯草芽胞杆菌对禽舍分离致病菌的抑菌作用研究”(2009-01)。 第一作者简介:王城,女,1984 年出生,内蒙古巴彦淖尔市人,大学本科,研究方向为动物营养。通信地址:110161 沈阳农业大学 351 信箱,E-mail: wangchengpp@yeah.net。 通讯作者:尹荣焕,女,1976 年出生,河北省安国市人,讲师,博士,主要研究方向为动物性食品安全。通信地址:110161 沈阳农业大学畜牧兽医学院, E-mail:yinronghuan@163.com。 收稿日期:2009-09-01,修回日期:2009-10-17。
0 引言 枯草芽孢杆菌属于一种常见的微生态制剂,在畜
牧业生产中,该菌一直作为益生菌被用于畜禽和水产 养殖中。朱茂山、王星云等研究发现枯草芽孢杆菌菌 株 B18 、B68 分别对黄瓜枯萎病菌和香蕉冠腐病菌具 有抑制作用[1-2]。芽孢杆菌具有较广的抗菌谱,对多种 病原真菌和细菌均有强烈的抑制作用,具有较高的潜 在生防利用价值[3]。大量研究证明,枯草芽孢杆菌可 以产生多种抗菌物质,其抗菌机理主要是通过产生脂 肽类、肽类、磷脂类、多烯类化合物和氨基酸类等抗生 素,达到抑制病原菌的作用[4-5]。枯草芽孢杆菌具有抑
关键词:枯草芽孢杆菌;致病菌;抑菌作用
中图分类号:S851.2+1
文献标志码:A
论文编号:2009-1757
Inhibitory Effect of Bacillus Subtilis on Pathogenic Bacteria from Poultry House Wang Cheng, Zhao Jie, Li Xuanliang, Yin Ronghuan
离菌株注射 2 只。空白对照组 2 只,每只腹腔注释灭菌 生理盐水 0.2 mL。观察 2 周并记录发病和死亡情况。 2 周后剖检全部鸡只,观察其病理变化,并无菌采取病 死鸡肝脏及其他发病器官涂片,镜检。 1.5 生化试验
参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《兽医微生物 实验指导》[7]进行纯化菌种的生化鉴定。 1.6 枯草芽孢杆菌的抑菌试验
对筛选出的 3 株菌株进行了生化鉴定。结果见 表 2。
生化试验 过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 苯丙氨酸脱氨酶试验 葡萄糖 O/F 试验 脲酶试验 V-P 试验 吲哚试验 硫化氢试验 凝固酶试验 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 乳糖 甘露醇 鉴定结果
表 2 生化鉴定结果
6 号菌 + + F + + + + + + + +
其中第 19 株菌根据其在普通营养琼脂和枯草芽
表 1 分离菌株的形态及培养特性
菌 染色 号 特性
菌体形态
普通营养琼脂培养基
麦康凯琼脂培养基
1
G+
球形
圆形,灰白色,表面整齐、光滑、湿润
无菌生长
2
G+
球形
圆形,灰白色,表面整齐、光滑、湿润
露滴状,粉色
3
G+
杆形
小菌落,低隆起,灰白色,圆形,光滑
无菌生长
4
无菌生长
10
G-
杆形
低隆起,表面光滑,半透明,黏液状
小菌落,圆形,粉色
11
G-
球形
低隆起,露滴状,圆形,光滑,半透明
无菌生长
12
G-
杆形
中等大菌落,厚薄不均,有不规则圆环, 无色、圆形、扁平、半透明
灰白色
13
G+
球形
大菌落,边缘锯齿状,有同心环,扁平 无菌生长
14
G-
球形
露滴状,灰白色,圆形,扁平
露滴状,粉色,隆起
将分离到的各致病菌菌株和实验室分离到的致病 性大肠杆菌、沙门氏菌纯培养物涂布于营养琼脂平板 上,将分离到的枯草芽孢杆菌接种在局部,培养 24 h, 观察。 2 结果 2.1 形态及培养特性
从沈阳农业大学畜牧兽医学院养鸡场带回的样品 中共分离出 19 种微生物,其中革兰氏阳性球菌 6 株,革 兰氏阴性球菌 6 株,革兰氏阳性杆菌 5 株,革兰氏阴性 杆菌 2 株,其形态和培养特性见表 1。
表 3 枯草芽孢杆菌的抑菌作用
菌种
抑菌圈
抑菌圈直径
金黄色葡萄球菌

0.065
变形菌属

0.041
肠球菌属

-ห้องสมุดไป่ตู้
致病性大肠杆菌

-
沙门氏菌

-
万方数据
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
目前,从防止生态环境污染入手,新的环境益生菌 在不断地产生,其应用方式也变得多样化,一些常用益
生菌的功能得到了增强。枯草芽孢杆菌作为畜牧业生 产中的常用益生菌,可在畜禽大肠中产生氨基氧化酶、 氨基转移酶及分解硫化物的酶,它们可将臭源吲哚化 合物完全氧化,将硫化物氧化成无臭、无毒物质,从而 降低血液及粪便中有害气体的浓度,并减少其向外界 的排放量 。 [8] 国内外学者进一步研究后发现,枯草芽 孢杆菌能够净化环境,利用其分泌的淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶脂肪酶等多种酶类来分解环境中的有害物质 。 [9] 近年来芽孢杆菌在养殖水体的净化、脱氮方面发 挥了巨大潜力,对养殖水体的化学耗氧量(COD)、硫
雏鸡感染后,第 5 天开始 6 号菌液感染组有 1 只雏
鸡死亡,另一只鸡则表现精神不振,闭眼昏睡,食欲减 小,剖检后可见浆膜出血,从肝脏分离培养得到注射的 菌种。其他鸡只均未见死亡,但 12、16 号菌注射后的 雏鸡均表现精神倦怠、羽毛不整、不食或少食,剖检腹 腔均见不同程度病变。其他人工感染雏鸡和对照组雏 鸡 2 周后未见异常变化。 2.4 生化特性
万方数据
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兽医学院养鸡场。 致病性大肠杆菌和沙门氏菌菌株:分别于发病鸡
场病死鸡肝脏、心脏、心血中分离,实验室保存。 1.2 禽舍枯草芽孢杆菌和其他微生物的采集
地点:沈阳农业大学畜牧兽医学院养鸡场。 将营养琼脂平板和枯草芽孢杆菌培养基各 10 板 分散于禽舍中不同地点 30 min,采集空气中的微生物, 用沾有生理盐水的棉签在禽舍中任意点涂抹,置于装 有灭菌生理盐水的试管中。将样品带回实验室备检。 1.3 分离培养与镜检 将采集的样品接种在营养琼脂平板和枯草芽孢杆 菌培养基,与采集的空气平板 37 ℃培养 24 h,挑选形 态不同的菌落再划线培养 24 h。挑取单个不同特征的 菌落染色,镜检,并作纯培养,将纯菌种接种于营养琼 脂平板、麦康凯琼脂平板等各 3 板,疑为枯草芽孢杆菌 的则接种于枯草芽孢杆菌培养基。 1.4 动物致病性试验 取各菌种纯培养物用灭菌生理盐水稀释至 109 CFU/mL,腹腔注射 1~3 日龄雏鸡,每只 0.2 mL,每种分
离、培养,并采用生化试验及动物试验等方法鉴定菌种及毒性,同时借助平板抑制试验检测枯草芽孢杆
菌分离菌株的抑菌作用。此研究分离的枯草芽孢杆菌菌株对致病性大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌属细菌
均没有抑制作用,但其对变形菌属细菌、金黄色葡萄球菌却表现出不同程度的抑制作用。说明用枯草芽
孢杆菌来抑制畜禽舍环境中的一些常见致病菌存在一定的潜力。
金黄色葡萄球菌
12 号菌 + + F + + + + + +
变形菌属
16 号菌 F + + + + + + +
肠球菌属
2.5 枯草芽孢杆菌抑菌作用结果 观察各个平板,在枯草芽孢杆菌周围有无抑菌圈
及其直径大小,用游标卡尺测量,任选 3 点取平均值, 结果见表 3。结果表明:在此次试验中分离到的枯草 芽孢杆菌菌株对致病性大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌属 分离菌均没有抑制作用,但对变形菌属分离菌、金黄色 葡萄球菌则具有一定的抑制作用,例图 1。 3 讨论
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161)
Abstract: The present work aims to study the inhibitory effect of Bacillus subtilis on pathogenic bacteria from poultry house. The microorganism collected from poultry house was isolated and cultured using conventional methods, and then, the strain and toxicity was identified using biochemistry and animal experiments. At the same time, the inhibitory effect of Bacillus subtilis isolated was evaluated with restrained slab experiment. The Bacillus subtilis isolated from the present work did not inhibit the growth of pathogenic E. coli, Salmonella, and Enterococcus, but it had inhibitory effect on Proteus spp bacteria and Staphylococcus aureus with different degree. Bacillus subtilis might be useful in the inhibition of common pathogenic bacteria from poultry horse. Key words: bacillus subtilis; pathogenic bacteria; inhibitory effect
中国农学通报 2010,26(3):23-26 Chinese Agricultural Science Bulletin
枯草芽孢杆菌对禽舍分离致病菌的抑菌作用研究
王 城,赵 杰,李旋亮,尹荣焕
(沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110161)
摘 要:研究枯草芽孢杆菌对禽舍分离致病菌的抑菌作用。采用常规方法对禽舍中采集的微生物进行分
无菌生长
无菌生长 无菌生长 —
19
G+ 杆形,有芽胞 低隆起,表面褶皱,灰白色,湿润
无菌生长
大小不等,隆起,灰白,湿润
万方数据
王 城等:枯草芽孢杆菌对禽舍分离致病菌的抑菌作用研究
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孢杆菌培养基上的生长特点,疑似枯草芽孢杆菌。 2.2 枯草芽孢杆菌分离菌株的鉴定
此试验对分离到的枯草芽孢疑似菌株进行了生化 鉴定,该菌株能分解葡萄糖产酸不产气,能分解甘露 醇、明胶,过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、脲酶试验、 硝酸盐还原试验、V-P 试验阳性,苯丙氨酸脱氨酶试 验、H2S 试验阴性,确定为枯草芽孢杆菌。 2.3 动物致病性试验结果
制病害能力,又是自然界中广泛存在的非致病细菌,所 以在农业生产中倍受关注。此研究即是对禽舍环境中 存在的枯草芽孢杆菌进行分离、筛选,并研究其对禽舍 中常见微生物包括一些病原菌,如沙门氏菌、大肠埃希 氏菌等的抑制作用,为研究畜牧生产中的环境益生菌 积累相关基础数据。 1 材料与方法 1.1 主要材料
培养基:营养琼脂,麦康凯琼脂,三糖铁琼脂,枯草 芽孢杆菌培养基,细菌微量生化反应管。
15
G+ 杆形,有芽胞 露滴状,粉色,圆形,边缘整齐
露 滴 状 ,粉 色 ,圆 形 ,边 缘整齐,
16
G+
球形
圆形,边缘整齐,凸起,光滑大菌落
干燥、粉红色,小菌落
17
G+
球形
露滴状,灰白,扁平,湿润,圆形
无菌生长
18
G+
杆形
大菌落,无隆起,黏液状,表面光滑
无菌生长
枯草芽孢杆菌培养基
无菌生长 无菌生长 无菌生长 大菌落,圆形,光滑,扁平,灰白色 露滴状,灰白色,圆形,光滑,隆起 无菌生长 无菌生长 无菌生长 无菌生长 大菌落,不规则形,扁平 无菌生长 中等大菌落,表面有同心环,灰白色, 低隆起 大菌落,边缘锯齿状,低隆起,灰白 无菌生长
G-
球形
菌落中等,圆形,光滑,扁平,灰白色
无菌生长
5
G+
球形
小菌落,圆形,光滑,扁平,灰白色
露滴状,粉色,光滑,隆起
6
G+
球形
大菌落,黄色,扁平
小菌落,粉色,隆起
7
G-
球形
黄色大菌落,表面整齐、光滑,低隆起 无菌生长
8
G+
杆形
露滴状,灰白,边缘整齐,有同心环
无菌生长
9
G-
球形
露滴状,圆形,扁平,略有粉色
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