遗传育种实验

实验一微生物抗药性突变株的分离

LB培养基：（胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 琼脂粉）

链霉素

灭菌空培养皿30个

实验前一天准备：LB 固体培养基100ml/三角瓶6瓶；接种大肠杆菌于5ml液体LB 6支，37℃震荡培养24h。

实验二紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应

四人一组，每班6组

菌种：枯草芽孢杆菌

培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g；NaCl 5g；水1000ml；；琼脂粉)；淀粉培养基（蛋白胨10g；NaCl 5g；牛肉膏5g；可溶性淀粉2g；琼脂；蒸馏水1000ml；）

无菌生理盐水50ml/瓶6瓶；10ml离心管20个；带玻璃珠小三角瓶6个；培养皿90个；离心管200个；10ml移液管，墙头1ml的3盒试剂：碘液

玻璃刮铲

实验1 微生物抗药性突变株的分离

【目的要求】

学习用梯度平板法分离抗药性突变株的原理和方法。

【基本原理】

抗药性突变株是指野生型菌株基因突变产生的对某

些化学药物的抗性变异类型，可在加有相应药物的培养

基平板上选出。抗药性突变是DNA分子的某一特定位

置的结构改变所致，与药物的存在无关，药物的存在只是

作为分离某种抗药性菌株的鉴别手段。在含有一定浓度

抑制生长的药物平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗

性突变的细胞在平板上长成菌落。纯化后进一步进行抗

性试验，就可以得到所需的抗药性菌株。

为了便于选择适当的药物浓度，本实验用常用的梯

度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板

(图：先倒人不含药物的底层培养基，把培养皿斜

放，凝固后将平皿平放，再倒入含有链霉素的上层培养

基，便可得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯

度平板。在平板上涂布经诱变处理的敏感菌，培养后从

链霉素浓度较高的部位长出的菌落中可分离到抗链霉素突变株。

【实验材料】

大肠杆菌Str s；LB液体培养基，LB琼脂培养基；链霉素，70％乙醇；无菌吸管，烧杯，试管，玻璃涂棒，水浴锅等。

【操作步骤】

1．接种大肠杆菌于盛有5 mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养24 h。

2．在热水浴中融化LB琼脂培养基。

3．倒10 mI。已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中，将培养皿一端垫起使培养基表面在垫起的一端刚到培养皿的底与边的交界处凝固(图上)。

4．在凝固的平板底部高琼脂一边标上“低”，放平后在底层培养基上加人每毫升含有100 ug链霉素的LB琼脂培养基10 mL。，凝固后制得链霉素浓度从一端的0 ug／ml。到另一端的100 ug／ml。的梯度平板(图中)。

5．用1 mL。无菌吸管吸取ml。大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃涂

棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。如用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸进平皿在板盖上充分冷却以免烫死细胞。

6．将平板于37℃培养48 h，结果如图下。

7．选择1～2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。

8．将平板倒置于37℃培养48 h。

【实验报告】

1．实验结果图示经一次培养和二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。

2．思考题

(1) 梯度平板中部的单个菌落被划线朝高药物浓度方向拉开是为了测试这些菌株的

抗性水平。你能设计几种不同的方法来测试这些菌株的抗性水平吗

(2 )是培养基中的链霉素引起了抗性突变吗请设计一个实验加以说明。

(3) 梯度平板法除用于分离抗药性突变株以外，还有什么其他用途

【注意事项】

1．制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。

2．严格无菌操作，勿将杂菌误认是抗药性大肠杆菌。

实验2 紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应

【目的要求】

(1) 了解紫外线的诱变原理；

(2) 学习并掌握物理诱变育种的方法；

(3) 观察紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658产生淀粉酶的诱变效应。

【基本原理】

一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、γ射线、高能电子流β射线及离子注入等。物理诱变剂(physical mutagen)中，以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变剂则受设备条件的限制，难以普及。紫外线(ultraviolet ray，UV)作为物理诱变剂用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80％左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。

紫外线的波长在200～380 nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253～265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80％是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA结构变化而造成的。DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。

经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活。因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射。注意，经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免在黑暗中突变被修复。

【实验材料】

(一)菌种

枯草芽孢杆菌BF7658。