大型大量质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书
高纯度质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://HighPure Plasmid Maxi Kit高纯度质粒大量快速提取试剂盒目录号：PL12试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次(PL1201)RNaseA（10mg/ml）－20℃750µl溶液P1 4℃77 ml溶液P2 室温77 ml溶液N3 室温77 ml去蛋白液PE 室温63 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇漂洗液WB 室温25 ml X 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。
有效防止了质粒被核酸酶降解。
3.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便，从150-300ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80 %左右。
质粒提取试剂盒说明书
质粒抽提：质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
实验原理：提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。
详细内容请参考《分子克隆实验指南》。
另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。
碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。
煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。
加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA 变性。
但是。
闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。
当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。
QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。
选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
nucleobond质粒大抽提中文说明书
nucleobond质粒大抽提中文说明书1.取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。
再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。
建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。
时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。
直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。
如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。
对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。
过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2.每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。
确保沉淀*散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已添加了RNaseA。
最高速度vortex10-20秒或更长时间，悬起沉淀。
一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。
如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开，或手指把沉淀弹开。
3.每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。
颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。
如果加入溶液I后细菌没有*散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。
遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4.每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5.12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。
如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间，直至沉淀充分。
QIAGEN质粒大提试剂盒
产品简介本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤器CS1，可有效的出去内毒素、蛋白质杂志；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。
推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-600μg左右。
注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。
2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
3.使用前先检查平衡液BL，溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
5.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
6.提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热，可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
7.实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
8.用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
质粒DNA 浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。
操作步骤：1.柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm（~8228×g）离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
质粒大提试剂盒说明书
北京索莱宝科技有限公司质粒大提试剂盒说明书货号：D1110规格：10次保存：常温保存，复检期一年。
试剂盒内容：RNaseA(10mg/ml)1ml溶液Ⅰ60ml溶液Ⅱ60ml溶液Ⅲ80ml漂洗液2×15ml洗脱液30ml吸附柱10个收集管(50ml)20个说明书1份产品说明：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，一般从50-100ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA，提取率达85-90%。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。
溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
操作步骤:第1页共3页1.收集50-100ml过夜培养的菌液11000rpm离心10分钟，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3.向离心管中加入5ml溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。
②作用时间不要超过5分钟，以免质粒受到破坏。
4.向离心管中加入7ml溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀(如菌液过多，可在此步放置5分钟，以尽可能的降解RNA)。
11000rpm离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。
ZYMORESEARCH质粒提取试剂盒说明书
ZYMORESEARCH质粒提取试剂盒说明书预期用途
本试剂盒可用于提取咽拭子样本中人上皮细胞、细菌和真菌的DNA。
本试剂盒提供的裂解液能快速有效裂解细胞，裂解产物能够直接用于PCR 扩增，并且灵敏度高，特异性强，省去了繁琐的核酸提取与纯化步骤，实现快速PCR检测。
对于病原微生物检测，流行病学调查、菌群调查及其它一些以口腔微生物为样本的核酸检测都非常适用。
操作步骤
1、待检拭子样本直接置于200IFatlyeL1中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管壁挤压数次后弃拭子；
2、吹打混匀，95℃孵育5min；
3、孵育后的样本12，000rpm离心2，3min，上清可直接用于PCR扩增，上清如不立即使用，需置于-20℃长期保存。
推荐使用咽拭子DNA快速提取扩增试剂盒（荧光PCR法），货号MKNJGNSWDLAQP008。
注意：
离心后的上清加入PCR反应体系的量不宜超过总体积的5%。
如偏好较小体积的反应体系，可将裂解产物稀释5倍或10倍后用作模板；
样本要求
用专用采样拭子，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
以上标本可立即用于测试，也可放置在-20℃条件下长期保存。
注意事项
2、如样本中扩增反应抑制物较多时，可将裂解后的上清稀释5倍作为模板，进行PCR扩增。
3、实验完毕用1%的次氯酸钠或75%酒精处理工作台和移液器。
introvigen试剂盒质粒大提操作步骤K2100-16
PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification KitsFor Mini, Midi, and Maxi preparation of Plasmid DNA Catalog numbers K2100-14, K2100-15, K2100-16, K2100-17, K2100-26, and K2100-27在开始之前作如下准备按照说明把RNase A加到Resuspension Buffer (R3) 中。
如果需要，把Lysis Buffer (L7) 放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
大量质粒提取过程注意事项对于所有的步骤，包括使用试管架或者核酸纯化架。
在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100-200ml （高复制数的质粒）或者250-500ml（低复制数的质粒）过夜培养。
分离大质量质粒DNA1平衡：把30ml的Equilibration Buffer (EQ1) 直接加入到过滤筒中，过滤筒插到PureLink® 高纯的大等管中，让溶液在管中靠重力流下。
2收集：收集过夜的LB培养基到一次性50ml，4000g，10分钟离心，去除培养基。
3重悬：加10ml的含有RNase A的Resuspension Buffer (R3)到细胞沉淀中，轻柔的重悬细胞沉淀到成为均质的细胞悬液。
4溶解：加入10ml Lysis Buffer (L7) 。
轻柔的反向混合盖盖子的管子直到形成均质的溶液。
不要涡旋。
室温下孵育5分钟。
5沉淀：加10ml Precipitation Buffer (N3)。
立刻轻柔的反向混合盖盖子的管子直到形成均质的溶液。
不要涡旋。
6过滤：把沉淀溶菌产物转移到管中，让其按重力流下。
可选择：用10ml的Wash Buffer (W8) 洗管子，让缓冲液顺重力流过管子。
7清洗：弃去内部的过滤筒。
加入50mlWash Buffer (W8) 洗管子，弃去从管子里流下的Wash Buffer (W8)溢出液。
AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作步骤
AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作步骤AxyPrep Maxi Plasmid Kit (AXYGEN) AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作说明实验准备:, 检查Buffer S1中是否已加入RNaseA。
, 检查Buffer W2中是否已加入无水乙醇。
, 检查Buffer S2是否出现沉淀，如有沉淀，在37?水浴中溶解沉淀，再平衡至室温。
,注意,Buffer S2不用时请立即盖紧，防止被空气中的CO中和。
, 2, 将Buffer S1，Buffer S3K和Buffer B放置4?预冷。
, 将洗脱液Eluent放置65?水浴中预热。
实验步骤:1. 将待提取的质粒对应菌液在5mL含有对应抗性的LB培养液中扩增培养过夜。
2. 次日，将5mL培养后的菌液接种至200mL含有对应抗性的LB培养液中扩增培养过夜。
3. 将菌液分装至5个50mL离心管中，每管40mL，4? 3000×g离心5min，彻底弃净上清。
4. 加入Buffer S1(已加RNaseA，4?预冷)，每管4mL，共20mL，涡旋充分重悬菌体。
5. 加入Buffer S2，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀，室温作用5min。
6. 加入Buffer S3K(4?预冷)，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀，室温作用5min。
7. 加入Buffer B(4?预冷)，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀。
8. 4?10000×g离心10min，小心取上清至新管，最终合并为2管。
9. (可选步骤)再次4? 10000×g离心10min，小心取上清至新管。
10. 将上步收集的上清全部加入Maxiprep syringe filter中，将注射器芯从上方推入，下方用纯化柱(Maxiprep column)盛接滤液。
11. 推注注射器芯，将液体滤至纯化柱中，同时在纯化柱下方连接输液器(预先剪除输液针)，并用10mL注射器负压反复抽吸，直至液体滤尽。
质粒大提操作
质粒大提操作手册（Qiagen试剂盒，无内毒素装）操作流程图准备工作检查试剂盒。
联系高速离心机。
准备50 ml（或更大）圆底离心管，灭菌备用。
准备试管架，实验前操作台上紫外线照射备用。
无菌离心管若干。
移液器与无菌吸头若干。
试剂准备：P3缓冲液4℃预冷异丙醇无水乙醇实验前取冰备用。
细菌培养：不要超过所推荐的最大，最好使用LB培养基，培养12-16小时，使每毫升细胞数达到3-4×109。
操作过程使用前准备工作QIAGEN-tips使用中需要保持直立。
LyseBlue的使用：LyseBlue和P1缓冲液以1：1000（10μl：10 ml）混合形成悬液，配制时要用力振荡充分混匀，加入P2后可形成蓝色溶液，加入P3后溶液变为无色。
将RNase A全部加入到P1缓冲液，使其浓度达到100 μg/ml。
将40 ml 96-100%乙醇加入到无内毒素水中，配制成70%无内毒素乙醇。
操作过程1、从平板上挑一个克隆到2~5 ml的抗性培养基中（一般是100 μg/ml的Amp），37 °C，300 rpm振荡培养8 hr。
2、如果是高拷贝质粒，取100 μl培养菌液加到100 ml抗性培养基中。
如果是低拷贝质粒，则取250 μl培养菌液到250 ml抗性培养基中，37 °C，300 rpm振荡培养12~16 hr。
3、6000 g，4°C离心15 min收获菌体细胞。
所得细胞可保存于-20℃备用。
4、加入10 ml的buffer P1（使用前可加入10 μl LyseBlue充分混匀）悬浮菌体细胞，充分混匀，可涡悬振荡，或者用吸头吹吸均匀。
5、加入10 ml的buffer P2，盖上离心管盖，上下用力翻转4~6次，以充分混匀溶液。
室温下放置5 min。
请勿涡旋振荡，裂解反应请勿超过5 min。
准备QIAfilter Cartridge：将盖子放置于QIAfilter Maxi Cartridge流出口上。
质粒提取试剂盒提取步骤
质粒提取试剂盒提取步骤
一、质粒抽提
1、细胞抽提：将细胞培养物加入或移植到一种含有高浓度酸性剂的6-8mm离心管里，将细胞离心至半浸没，以保持溶液沉积在离心管壁上。
2、除去膜：添加浓酸溶液（如硫酸氢钠（NaHSO3）），膜结构会被溶解，使其细胞表面的结构被破坏，从而除去细胞的膜。
3、去染色：添加RNA隔离试剂，脱去细胞染色物质以获得高纯度的RNA质粒。
4、离心：离心至接近干旱，并移除液体，这时的混合液中已只剩下RNA质粒。
5、抹拭：将离心管倒过来，将质粒在管壁上均匀抹拭，这时的RNA 质粒就会在管壁上附着。
6、冷冻干燥：将管子放到冰上，将管子中的水分蒸发冷冻干燥，使RNA质粒固定在管壁上。
7、溶解：最后，将RNA质粒溶解到可以用于后续实验的溶液中。
二、PCR扩增：
1、PCR建库：将抽提的DNA放入PCR管中，加入PCR反应混合液（包括DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2），并添加特长引物，即可进行PCR 反应。
2、PCR扩增：使用PCR反应温度循环加热并添加高分子量DNA来将DNA片段扩增。
3、电泳：将PCR配型片段送到电泳仪中，使用添加特异性引物的特定电泳条件，检测和鉴定基因突变。
质粒大规模提取方法
E.Z.N.A. Plasmid Maxi Kit (D6922-01)质粒大规模提取试剂盒注意：1．使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存2．加84ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.室温保存除试剂盒外还需准备：配有浮桶式转头(吊桶式转头)的离心机可达到12000×g的高速离心机50ml无菌离心管高速离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)1．将带有目的质粒的大肠杆菌接种到200－500ml LB（含氨苄青霉素50μg/ml），1－4升培养瓶中37℃震荡培养过夜（12-16h）需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2．取500ml菌液装入适当管子(推荐用250ml离心瓶)中，室温下3500-5000×g离心10min3．小心去上清，用洁净纸巾吸干管壁残留液体。
加7.0ml溶液Ⅰ，吹打数次，用旋涡振荡仪充分悬浮沉淀4．移入50ml至少可承受12000×g的离心管，加7.0ml溶液Ⅱ，轻轻来回翻转混合7－10次，至澄清裂解液注意：必须室温下孵育5－10min避免大力混合，以减少对染色体DNA的机械力切割，提高质粒纯度5．加10ml溶液Ⅲ，温和倒转数次，至有絮状沉淀形成室温孵育5min并不时混合室温离心10min得到致密的基因组DNA和碎屑团块6．特别小心地吸取上清，加到装配好容积50ml离心管的大型吸收柱，上盖，装入吊桶式转头，室温3000-4000×g离心5min注意：确保没有搅动沉淀以保证质粒回收率有必要牺牲2－4ml溶菌产物单次最多加25ml溶菌产物，如果较多，分2次加入可用此管直接重复步骤6注意：接下来的步骤都会用到浮桶式转头(吊桶式转头)离心机（用固定角转头会使提供的50ml离心管变形或破裂）7．加50ml HB缓冲液到吸收柱，上盖，室温3000-4000×g离心5min（此步为确保除尽剩余蛋白，同时使后面的操作得到的是高纯度DNA）8．加10ml用乙醇稀释的DNA Wash Buffer，上盖，室温3000-4000×g离心5min，弃掉滤过液注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签如果经过冷冻，用前必须恢复室温9．此步可选：重复步骤810. 加10ml纯乙醇，室温3000-4000×g离心5min，弃掉滤过液11. 将空管上盖3000-4000×g离心10min甩干（用移液器去掉甩到离心管中的乙醇）注意：此步必做！残留的乙醇会影响接下来的步骤12. 洗脱DNA之前可用以下方法进行干燥，以得到更干燥的吸收柱（如果没有真空箱/室，可直接执行步骤13）方法A：取出吸收柱，将吸收柱在真室箱/室中15min，执行步骤13方法B：取出吸收柱，在65℃真空干燥箱或恒温箱中干燥10-15min，执行步骤1313. 将吸收柱放入干净50ml离心管，加1-2ml(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，3500×g离心5min，一次可洗脱70%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）建议：洗脱前，如果将吸收柱放入70℃热水中浸泡2min，会明显提高回收率同时得到高浓度DNA注意：清除在吸收柱内部O形圈边缘的DNA Wash Buffer残留非常重要如果在洗脱前没有真空干燥吸收柱，最后需对质粒DNA进行净化，方法如下：加氯化钠到洗脱液至终浓度200mM，再加0.8体积的异丙醇，旋涡振荡混合，10000×g离心10min，用70%乙醇清洗沉淀，10000×g离心10min，轻轻倒出上清，短暂风干，用200-500μl无菌去离子水或TE 缓冲液再悬浮DNA14. 检测：方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度DNA浓度＝260nm吸光度×50×稀释因子μg/ml高质粒拷贝数能达到500ml培养液得到1mg DNA，如果260nm吸光度/280nm吸光度大于1.8，说明核酸大于90%。
质粒提取试剂盒说明书
1使用前，在试剂盒中加入一小管核糖核酸酶到溶液一中。
保存在4°C2向dnawas缓冲液浓缩液中添加60 ml 100%乙醇，并在室温下储存除此之外，还需要一台容量为13000×G的离心机无核酸酶离心管无菌去离子水或te缓冲液纯乙醇操作步骤：（萃取过程在室温下进行）1在10-20ml试管中，将携带所需质粒的大肠杆菌接种于5mllb培养基lb（含50μg/ml 氨苄西林）中，37℃≤0.2培养12-16h，需要注意的是，常规的质粒提取使用的是Enda 阴性的大肠杆菌，如DH5α和JM109。
2取1.5～5ml常温菌液10000×g，离心1分钟，除去上清液。
三。
加入250.0.8l溶液I（含RNase A），用旋涡振荡器摇匀，直至细胞完全悬浮。
（用移液管再消耗）4加入250.0.8l溶液II，轻轻转动离心管4-6次，得到澄清的热解溶液。
最好在室温下孵育2分钟。
剧烈的混合会切断染色体DNA，降低质粒的纯度。
（储存溶液II时应拧紧盖子）5加入350.0.8l溶液III，轻轻倒置并混合几次，直到出现白色絮状沉淀6在室温下以13000×g离心10分钟后，会形成白色沉淀并迅速进入下一步7小心处理上清液，并用2ml离心管转移到干净的吸收柱中。
确保没有沉淀物和细胞碎片被吸入。
在10000×g室温下离心1分钟，直至裂解液完全通过吸收柱8取纯化后的蛋白质，在离心条件下，取剩余蛋白1.500×1.0，进行离心分离。
如果下一步不需要高纯度质粒，如酶消化等筛选方法，这一步可以省略9滤液弃去，用100%乙醇稀释的750.0.8l洗涤缓冲液冲洗吸收柱，在10000×g离心1分钟，滤液丢弃。
注意：浓缩前必须用纯乙醇稀释洗涤液。
参见标签中的方法如果结冰，使用前必须恢复到室温10此步骤可选：加入750.0.8l洗涤缓冲液清洗吸收柱1113000×g吸收柱必须离心2分钟，以确保去除乙醇。
质粒 DNA 提取及纯化试剂盒 说明书
质粒DNA提取及纯化试剂盒使用说明书产品简介GBpure Plasmid试剂盒是质粒DNA提取领域中的突破性进展，它有效结合了细胞裂解，杂质去除，及质粒纯化等功能。
无需过柱，不用酚氯仿抽提，确保所提质粒DNA高产量、高质量。
并且可按用户需求灵活制定容量大小。
产品特色●简单:添加GBpure Plasmid试剂使细胞裂解，释放DNA，及杂质去除有效结合起来。
●延展性: 一盒GBpure Plasmid试剂盒可以进行：Miniprep, Midiprep或Maxiprep;无需购买额外的试剂盒。
●方便:无需过柱，无需过滤，无需高效液相色谱法，无需超速离心机，无需特殊设备。
●无毒性:无酚、氯仿，无饱和正丁醇，无溴化乙锭，无氯化铯。
●快速:一分钟完成菌体沉淀，五分钟完成颗粒细菌碎片，10分钟完成沉淀质粒DNA，整个过程只需30分钟。
●高纯度:A260/A280 = 1.7-1.8. 所得质粒DNA无任何抑制剂，可应用于所有分子生物学的操作。
●高产量: 从1 ml (mini), 10 ml (midi), 100 ml (maxi) 的过夜培养基中获得大约5 μg,50 μg, 500 μg的DNA质粒。
●质优价廉订购信息与储存条件室温保存。
有效期12个月。
使用限制：本产品属科研专用。
不用于人类或动物的诊断、治疗。
GBpure Plasmid MiniPrep Protocol从1-2 ml过夜细菌培养中提取5-10 μg质粒DNA操作方法1.取1- 2 ml过夜培养菌液，装入2 ml离心管中，室温最大速度（14,000 × g）离心1 min沉淀菌体，完全弃除上清。
2.加入300 μl Buffer P1 重悬液，充分混匀震荡菌体沉淀10-15 sec，使其完全分散开，至无絮块存在。
3.加入300 μl Buffer P2 裂解液，轻轻颠倒离心管3-5次，室温放置1 min，使细菌完全裂解，此时溶液应呈透明。
.质粒的提取(试剂盒)
提质粒（试剂盒）实验前准备1．第一次使用，RNase A全部加入Buffer S1中，4℃贮存。
2．无酶枪头，离心管。
3．第一次使用，Buffer W2 concentrate 加入无水乙醇（比例见瓶上）4．Buffer S2 若沉淀，则应于37℃温浴加热溶解并冷却至室温再使用。
步骤1．取1-4ml 在LB培养基中培养过夜的菌液，（若为丰富培养菌液体积应该减半或更少）12000g 离心1Min，尽弃上清。
2．加250ul Buffer S1，吹散均匀。
（目的，裂解菌液）3．加250ul buffer S2 ，温和充分上下翻转4-6次混合均匀（充分裂解，若充分则形成透亮溶液）时间不能超过5Min。
注意：buffer S2 用完，立即拧紧瓶盖，防止CO2 与NaOH反应不能剧烈摇晃，否则导致基因组DNA污染。
3的目的是使蛋白质变性4．加入350ul buffer S3，温和充分上下翻转6-8次，12000g 离心10 Min目的是去除蛋白质5．吸取4中上清，转移至制备管中，置于2ml 离心管中，12000g ，1Min 期滤液（目的吸附DNA）6．将制备管置回离心管中，加500ul buffer W1 12000g 1min 弃滤液。
静置5min ，弃滤液，再加W27．将制备管置回离心管中，700ul buffer W2，12000g 1min 弃滤液，静置5min后重复一次。
（确保盐分被完全清除，消除对酶切反应的影响）8．将制备管置回2ml离心管中，12000g 1min 静置5min9．将制备管置于新的1.5ml 离心管中，在制备管膜中央加60-80ul Eluent或去离子水，室温静置1min，12000g 1min。
（不能碰到膜，Eluent 65℃可提高效率）10．离心下的液体中就含有质粒，收集于一管中（-20℃保存）跑胶检测制胶：1%的琼脂糖胶（20ml 1X的TBE，0.2g 的琼脂糖，2ul的goldview（万分之一）一般8ul的质粒混合2ul的loading buffer （loading buffer 在4度冰箱，量的计算方法为，loading buffer 本为6X，混合质粒变成1X）Maker 是5ui的DNA Ladder （-20度冰箱中）电压是120V，跑过胶的三分之二即可荧光和化学发光成像系统检测放胶——点击电脑上的紫外透射—再点击590—再点击Capture 找到成像，保存。
QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1)按照说明把RNase A加到Buffer P1 中,混匀,放到2-8度储存。
选作:按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12)pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3)检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物,可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4)准备异丙醇。
5)用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml(高复制数的质粒)或者250ml(低复制数的质粒)过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌,在6000g,4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1(根据SBI要求加倍,用20ml)重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2(根据SBI要求加倍,用20ml),剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀,室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂,溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间,打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3(根据SBI要求加倍,用20ml)到此溶菌产物中,剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂,混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中,室温放置10min,不要插入活塞。
打开针口的密封盖,轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中,充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上,加入10ml Buffer QBT,让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
质粒大量抽提试剂盒说明书
宁波保税区西区创业大道7号2C-1,315800, 电话：+86-574-86822306 传真：+86-574-26893101, sales@质粒大量抽提试剂盒使用说明书质粒大量抽提试剂盒使用说明书（（离心法离心法））产品编号 产品名称包装 DNAP002质粒大量抽提试剂盒（离心法）6×包装清单包装清单：：Solution Ⅰ（溶液Ⅰ） 60ml Solution Ⅱ（溶液Ⅱ） 60ml Solution Ⅲ（溶液 Ⅲ） 84ml Wash Solution （冲洗液） 21ml Elution Buffer （洗脱液）9ml Affinity Column （质粒纯化柱）6个 Collection Tube （废液收集管） 6个 Instrution （说明书）1份操作步骤操作步骤：：1. 取40ml 过夜培养菌液，放于Collection Tube 中，11,000－13,000rpm 离心2分钟，离心速度低时应适当延长离心时间。
2. 弃上清，再加入40ml 菌液，重复步骤1。
弃上清，离心1分钟，用吸头吸干多余液体。
3. 加10 ml 含RNase A 的Solution Ⅰ，用吸头冲打沉淀或用振荡器使菌体充分混悬。
4. 加10 ml Solution Ⅱ，上下翻转混合6－10次，使菌体充分裂解，形成清亮溶液。
5. 加14 ml Solution Ⅲ，上下翻转混合6－10次，于4℃静置10分钟，应见大量白色沉淀生成。
6. 于4℃，11,000rpm 离心30分钟。
离心期间，将Affinity Column 放在Collection Tube 中。
7. 将上清倒入准备好的Affinity Column 中，11,000 rpm 离心2分钟。
也可将过柱液重新倒回AffinityColumn 中，11,000 rpm 离心2分钟，以增加回收率。
8. 弃过柱液，加8.4ml Wash Solution 于Affinity Column 中，11,000 rpm 离心2分钟。
质粒大抽步骤
质粒大抽（手提）步骤资料来自网络，适当改进试剂配制：Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。
Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
1M NaOH (400ml )：分子量：40，秤取16g NaOH，溶于400ml 双蒸水中。
2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml 双蒸水中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。
10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。
Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml 双蒸水，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。
Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml 双蒸水，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。
(注：不需要定容，严格按步骤操作)Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml 双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。
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杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://
PhasePrep EndoFree Maxi Kit
大型/大量质粒提取试剂盒
目录号：PL1401
适用范围：
适用于大量高纯或者转染级质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备
试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成保存20次（PL1401）
RNaseA（10mg/ml）-20℃ 1.3ml
溶液P1 4℃130ml
溶液P2 室温100 ml
溶液PⅢ室温110 ml
杂质清除剂A 室温 3 ml
杂质清除剂B 室温30 ml
内毒素清除剂-20℃10 ml
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
储存事项:
1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg /ml）
置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在－20℃!
3.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热
几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时
盖紧盖子。
产品介绍：
本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。
纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。
纯化后期过程均在1.5ml 小离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。
本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。
可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达5μg/μl。
超螺旋比例可高达95%，无内毒素，转染效果好。
产品特点：
1.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便、从150-200
ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5-2mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。
2.获得的质粒产量高，超螺旋比例可高达95%，浓度可达5μg/μl，纯度好，可直接
用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
3.内毒素含量极低（< 0.1EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。
注意事项
1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝
质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对
DNA的损坏。
3.DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。
如未见沉淀，担心DNA丢失，
可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。
4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260
值为1相当于大约50μg/ml DNA。
电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。
本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。
5.质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以
知道。
处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确切大小。
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
⇨提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8℃保存。
1.取过夜培养菌150 ml左右菌液（最大不超过180ml-200ml），装入合适的离心瓶
中，10,000 x g于4℃离心2 min沉淀菌体，完全弃除上清。
2.加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。
细菌悬液移入50 ml离心管中，室温放置3~5 min。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置4-5 min，使细菌完全裂解，
溶液透明。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。
此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。
如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4.加5 ml溶液PⅢ，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。
上述
裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml 离心管中。
加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
5.加入10 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。
注意：使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。
如果你习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。
6.于4℃ 12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干
残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。
DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。
注意：异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但
是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。
7.加入1.4 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽
然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。
然后将质粒溶液转入2个新的1.5 ml离心管中（每个700μl）。
可选步骤（一般不需要）：如果菌株RNA丰富有微量RNA残留，可在此步骤后将质粒溶液60℃孵育15 min消化RNA。
8.每管加入55μl杂质清除液A，颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的
内毒素清除剂，颠倒旋转7-10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置>=5分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。
注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55μl杂质清除液A，充分混匀后冰上放置5分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤11。
9.42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。
10.室温14,000 x g离心5 min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须
至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上）。
上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。
将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤9-10。
11.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约750μl），轻柔混匀，4℃
14,000 x g离心10 min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。
12.每个离心管加适量TE或者纯水（100~200μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以
辅助溶解）。
要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。
最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA（高达5-10μg/μl）。
如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。