蛋白样品制备

双向电泳之样品的制备

2008-04-02 21:58:37| 分类：默认分类|举报|字号订阅

一般性原则：

样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：

1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；

3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。

样品制备程序：

⒈培养细胞（culture cell）样品处理方法：

培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：

(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％Pharmalyte pH 3-10.

其他常用的裂解缓冲液如下：

(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabl℃proteinase inhibitor;

(C) 加入0.3 -1% SDS 在95 ℃煮样品5mins ，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。

总蛋白抽提程序：

（1）培养细胞的收集；

（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS；

（4）加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100µL 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；

（5）4℃，40,000g，离心1h；

（6）吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃备用。

组织样品处理方法：

对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：（1）在液氮中研碎叶片；

（2）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%ß-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20 ℃的冰浴；

（3）让蛋白质沉淀过夜然后离心（4℃，40,000g, 1h），弃上清；

（4）重悬沉淀浮于含0.07%β -巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；

（5）离心（4℃，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；

（6）用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4℃，40,000g, 1h）。

Lysis buffer B

(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer C

40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O

Lysis buffer D

Lysis buffer E

(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and

a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer F

100 µL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT,25% v/v glycerol

注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

其中C-F 是分步法提取的4 种裂解液配方, C 适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F 适于提取难溶的沉淀蛋白。

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蛋白质组研究第一步：双向电泳蛋白样品制备[选购宝典]

【字体：大中小】 时间：2006年02月13日来源：生物通

摘要：

在直击蛋白质组学研究技术全过程一文中就提到过，目前蛋白质组学研究主要是两条互补的实验工作流程——基于凝胶的工作流程（Gel-based workflow）和基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）。其中对于前者而言，双向电泳技术是核心，而这核心中的核心就是电泳的第一步：蛋白样品制备。这是因为不像双向电泳的其它过程有仪器，有大致相似的操作程序，蛋白样品由于其结构特性各异，又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰，所以不可能有一个通用的技术，只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意：在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性，也需要将其看成是独特而奇妙的个体，结合以往经验但又不拘泥于经验，才能真正揭开她神秘的面纱。