蛋白样品制备
蛋白质质谱样品制备步骤
蛋白质质谱样品制备步骤
蛋白质质谱样品制备步骤如下：
蛋白质破碎：根据细胞或组织类型的不同，选择不同的破碎方法。
常用的破碎方法包括液氮研磨、超声破碎、反复冻融、机械匀浆等。
蛋白沉淀：在破碎后的溶液中加入蛋白质沉淀剂，使蛋白质沉淀析出。
常用的蛋白质沉淀剂包括丙酮、甲醇、乙醇等。
洗涤：去除沉淀物中的杂质，如盐分、糖类等。
常用的洗涤液为低浓度的有机溶剂或缓冲液。
干燥：将洗涤后的蛋白质沉淀物干燥，以便进行后续的质谱分析。
常用的干燥方法包括冷冻干燥和真空干燥。
酶解：将干燥后的蛋白质沉淀物进行酶解，将其分解成肽段。
常用的酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶。
肽段分离：将酶解后的肽段进行分离纯化，以便进行后续的质谱分析。
常用的分离方法包括凝胶电泳、色谱技术等。
标记：对分离纯化后的肽段进行标记，以便在质谱分析时进行定量和鉴定。
常用的标记方法包括同位素标记、化学荧光标记等。
质谱分析：将标记后的肽段进行质谱分析，测定其分子量和序列信息。
常用的质谱仪有MALDI-TOF、ESI-MS等。
通过以上步骤，可以制备出适合进行蛋白质质谱分析的样品，为后续的蛋白质鉴定和功能研究提供基础。
Western-blot实验操作步骤
Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点1.选择适合的样品预处理方法：蛋白质样品预处理的方法包括提取、富集和纯化等。
常见的方法有溶细胞法、组织破碎法和亲和层析法等。
根据具体实验目的和样品特点，选择适合的方法进行样品预处理是确保蛋白质样品质量的重要因素。
2. 选择合适的蛋白质溶液：根据目的不同，选择适于蛋白质分离的缓冲液和胶液。
常用的缓冲液有Tris-Glycine、Tris-Tricine和Tris-Acetate等，常用的胶液有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺/聚丙烯酰胺共聚物凝胶等。
根据蛋白质的特性和实验要求，选择合适的缓冲液和胶液可以提高分离效果和样品质量。
3. 蛋白质样品质量检测：在进行双向电泳实验前，需要对蛋白质样品进行质量检测。
常见的检测方法包括BCA法、Lowry法和Bradford法等。
这些方法可以测定样品中的蛋白质浓度，以确保实验的准确性和可重复性。
4.样品处理与加载：在进行双向电泳实验时，需要将蛋白质样品进行处理和加载，以便进行分离和鉴定。
样品处理的方法包括蛋白质还原、脱脂和蛋白质标记等。
蛋白质还原可使用还原剂如二巯基乙酸、巴布威和三丁基磺酸等，蛋白质脱脂可使用胰酶和胰酶胰凝乳酶等。
加载样品时，需要控制样品数量和均匀性，避免过多或过少的加载，以避免样品定位和分离差异。
5.电泳条件的优化：电泳条件的选择和优化是双向电泳实验的关键。
根据样品特性和实验目的，调整电场强度、升温速率和电泳时间等参数，以获得较好的分离效果。
此外，还需要注意电泳温度的控制，避免样品的热失活和电场影响。
6.截胶和染色：双向电泳实验结束后，需要进行截胶和染色步骤，以检测和鉴定分离的蛋白质。
截胶可使用染色剂如胭脂红和银染等，染色后可以通过人工或自动扫描仪对蛋白质进行定量和定位。
7. 数据分析和解释：双向电泳实验获得的数据需要进行分析和解释。
常见的数据分析方法包括质谱分析、2D胶电泳图像比较和蛋白质鉴定工具（如万得鉴定和Mascot等）。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
如何鉴定蛋白质和蛋白质样品制备的建议
如何鉴定蛋白质和蛋白质样品制备的建议随着高分辨率质谱分析技术的发展，蛋白质质谱方法已经变得相当复杂。
一次实验完成鉴定低丰度蛋白质样品和多个蛋白质样品已不再困难。
然而，由于质谱的高灵敏度，外源引入的蛋白质可能会在质谱中引起假阳性。
因此，在制备蛋白质样品时，我们必须小心避免引入外源蛋白质污染物。
此外，蛋白质样品的制备还需要使用与质谱检测兼容的溶液和试剂，这可以大大提高质谱鉴定的准确性。
根据经验，我们将向您介绍蛋白质质谱鉴定的每个详细过程，以及在蛋白质样品制备中应注意的事项。
蛋白质质谱的一般过程首先，您需要破碎细胞或组织样品，有很多方法可以破碎它们。
大多数细胞可以通过使用常见的细胞裂解试剂（如RIPA缓冲液），添加蛋白酶抑制剂和还原剂来裂解。
组织可以通过低温均质、液氮冷冻等方法破碎。
其次，将样品以12000rpm的转速离心10分钟，去除不溶性细胞成分。
液体蛋白质样品可以使用抗体进行富集、纯化和IP处理，然后可以浓缩待检测的蛋白质。
蛋白质也可以使用1D/2D-PAGE凝胶分离。
浓缩的液体蛋白质消化后，采用LC-MS/MS进行分析。
要求蛋白质凝胶样品切除与目标蛋白质分子量相同的蛋白质条带，并对蛋白质进行凝胶内消化和质谱检测。
分析质谱鉴定的数据，获得高度可靠的蛋白质肽序列，然后与蛋白质数据库进行比较，得到蛋白质鉴定。
样品类型细胞样品：微生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌和细菌。
组织样品：动物组织、植物组织。
体液样品：血清、血浆、尿液等。
样品数量样品类型蛋白质。
细胞样品。
动物组织。
植物组织。
血液(EDTA抗凝)。
血清。
尿液。
酵母，微生物样品。
样品量100μg。
1×107。
1g。
200mg。
1mL。
0.2-0.5mL。
2mL。
200mg（干重）。
蛋白质样品制备的建议浓缩样品。
蛋白质样品可以通过沉淀、膜分离、分离柱、冷冻干燥等多种方法进行浓缩。
用户应根据样品的特性选择合适的方法。
SDS样品溶液可以洗脱色谱样品中的蛋白质，从而保持样品的小体积。
蛋白样本制备与WB
主要内容
一 蛋白样本制备的目的与重要性
二 蛋白样本制备的总体策略和原则
三 案例分析—细胞总蛋白的提取
1 细胞裂解液配方分析与技术要点 2 表面活性剂的选择
3 蛋白酶抑制剂与其”鸡尾酒”
4 磷酸酶抑制剂
四 蛋白提取产品选择指南
1 核蛋白与转录因子EMSA分析
2 膜蛋白提取
3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒
蛋 白 酶 抑 制 剂 选 择 指 南
4
磷
alkaline phosphatase as well as serine/threonine protein phosphatases such as PP1 and PP2A.
Alkaline phosphatases as well as protein threonine phosphatases (PTPs). 氟化钠 焦磷酸钠 正钒酸钠
表 面 活 性 剂 选 择 指 南
选用表面活性剂考虑的因素
参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂 工作条件下表面活性剂的溶解性 考虑表面活性剂的去除方法 保护蛋白活性时,不仅考虑使用表面活性剂的种类还有浓度 根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类 表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量 使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等 尽量使用毒性较低的表面活性剂 因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离 有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表
DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度. 可以适量加入Glycerine,稳定蛋白.
四 蛋白样本制备产品选择指南
1 核蛋白样本制备
抽提原理 低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白
蛋白质谱样品制备指南
蛋白质谱样品制备指南英文回答：Protein sample preparation is a crucial step in proteomics research. It involves a series of procedures to extract, purify, and concentrate proteins from biological samples for further analysis by mass spectrometry. In this guide, I will provide you with a step-by-step approach to protein sample preparation.1. Sample Collection:The first step is to collect the biological sample, such as cells, tissues, or body fluids. It is essential to handle the samples carefully and ensure their integrity during collection to obtain reliable results. For example, when collecting blood samples, it is important to use sterile collection tubes and avoid hemolysis.2. Sample Lysis:After sample collection, the next step is to lyse the cells or tissues to release the proteins. This can be achieved by using lysis buffers containing detergents, protease inhibitors, and other additives. Gentle homogenization or sonication can also be employed to facilitate cell lysis. For instance, I typically use RIPA buffer supplemented with phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and phosphatase inhibitors to lyse cells.3. Protein Extraction:Once the cells or tissues are lysed, the proteins need to be extracted from the cellular debris and other contaminants. This can be accomplished by centrifugation at high speeds to pellet the insoluble material, followed by careful collection of the supernatant containing the soluble proteins. It is important to avoid contamination from DNA, RNA, or other interfering substances during this step. For example, I often perform a phenol-chloroform extraction to remove nucleic acids from my protein samples.4. Protein Quantification:After protein extraction, it is crucial to determinethe protein concentration accurately. This can be doneusing various methods such as the Bradford assay, bicinchoninic acid (BCA) assay, or spectrophotometry.Protein quantification allows for the normalization of sample loading in downstream analyses. For instance, I frequently use the BCA assay to quantify my protein samples.5. Protein Digestion:To analyze proteins by mass spectrometry, they need to be digested into smaller peptides. The most commonly used protease for this purpose is trypsin. The protein digestion is typically performed in a buffered solution at an appropriate temperature for several hours. It is importantto optimize the digestion conditions to achieve completeand reproducible digestion. For example, I usually digestmy proteins overnight at 37°C using a tryp sin-to-protein ratio of 1:50.6. Peptide Cleanup:After protein digestion, the resulting peptide mixture needs to be cleaned up to remove salts, detergents, and other contaminants. This can be achieved using solid-phase extraction (SPE) cartridges or other purification methods. It is important to ensure efficient peptide recovery and minimal sample loss during this step. For instance, I often use C18 SPE cartridges to purify my peptide samples.7. Sample Concentration:Finally, the purified peptides need to be concentrated to a suitable volume for mass spectrometry analysis. This can be done using techniques such as vacuum centrifugation or solid-phase extraction. The concentrated peptide sample is then ready for further downstream analysis, such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). For example, I typically use vacuum centrifugation to concentrate my peptide samples.中文回答：蛋白质样品制备是蛋白质组学研究中至关重要的一步。
蛋白质组学样品制备注意事项
蛋白组学样品制备常规流程及注意事项一、细胞, 组织裂解●Lysis buffer (SDT, RIPA…)： ThermoFisher提供了针对于各种样品的解缓冲液●Detergent: SDS, CHAPS, NP40… (破坏细胞膜，蛋白质变性）●Reducing agent: DTT… (打开二硫键，使得蛋白质结构更为开放，更易酶解)●Urea: 增加蛋白质的可溶性，适用于提取全蛋白二、蛋白质抽提三、样品蛋白质含量测定、还原烷基化还原烷基化原理: 蛋白质不能从PAGE胶里被抽提出，而肽段则可以被抽提出，打断蛋白质的二硫键，破坏蛋白质二级结构，是蛋白质结构松散，增加蛋白质酶切效率。
四、蛋白水平的预分级或蛋白质免疫沉淀五、蛋白质酶解i.胶内酶解 (In-gel digestion)●将考染后的SDS-PAGE切成小块●用100mM NH4HCO3/30%ACN 脱色●在胶内进行 DTT, IAA●在NH4HCO3溶液体系中加入酶，在胶内进行酶解●用60% ACN/0.1% TFA 从胶中抽提生成的肽段ii.FASP: Filter aided sample preparation●采用滤膜装置进行溶液置换（10K, 20K, 30K）●使用尿素可以更有效的除去溶液体系中的去垢剂（如SDS）●最后置换至NH4HCO3 or TEAB 溶液体系进行蛋白质酶切（pH 在8.0左右）●酶解完成后收集滤膜的流穿组分得到肽段原理: 蛋白质不能通过滤膜，而酶解生成的肽段则可以通过。
丙酮沉淀是另一种去除去垢剂的方法，从而可进行溶液内酶解。
iii.蛋白酶的选择：最为常用的蛋白酶: Trypsin（保持胰酶处于低温，并且保存在酸性环境中，以防止胰酶自身酶解）●特异的切断C端为Arg, Lys的肽键（若Arg, Lys后紧跟Proline, 酶切效率降低）●生成的肽段平均长度为9个氨基酸●胰酶酶解生成的肽段至少为2+价，易于离子化其他一些蛋白酶，酶切位点的特异性可在搜库软件中查找。
蛋白盐析实验步骤及注意事项
蛋白盐析实验步骤及注意事项蛋白盐析是一种用于分离和纯化蛋白质的实验方法。
下面是蛋白盐析实验的步骤及注意事项：步骤一：样品制备1.首先，准备蛋白样品。
可以从细胞裂解物、组织提取物或培养物中获取蛋白样品。
2.制备适量的样品溶液，添加必要的缓冲剂，以调节溶液pH值，并使其适应盐析条件。
步骤二：筛选适宜的沉淀剂1.准备一系列不同盐浓度的盐溶液。
常用的盐包括氯化铵、硫酸铵等。
2.在实验过程中，可以通过比较不同盐溶液对蛋白沉淀效果的差异来确定最适宜的沉淀剂。
步骤三：盐析实验1.向样品溶液中加入适量的盐溶液，使盐浓度逐渐增加。
2.搅拌样品溶液，促进蛋白质和盐的相互作用。
3.观察样品的混浊度变化。
盐的加入会引起蛋白质沉淀，形成白色沉淀物。
4.根据样品中蛋白质的特性调整盐浓度，以达到最佳分离效果。
步骤四：沉淀物的收集1.当混浊度降低到一定程度时，停止盐的加入。
2.用离心机将样品离心，使蛋白质沉淀于离心管底部。
3.倒掉上清液，保留沉淀物。
步骤五：沉淀物的洗涤1.向沉淀物中加入适量的洗涤缓冲液，搅拌，让沉淀物重新悬浮。
2.离心样品，倒掉液体，保留沉淀物。
3.重复上述洗涤步骤，以去除残留的盐和杂质。
步骤六：沉淀物的溶解1.向沉淀物中加入适量的溶解缓冲液，用于溶解蛋白质。
2.搅拌样品溶液，在适当的温度和时间下，使蛋白质完全溶解。
步骤七：纯化蛋白质1.将溶解的蛋白质样品进行进一步的纯化方法，如色谱法、电泳法等。
注意事项：1.在整个实验过程中，应注意实验室的清洁卫生，防止外源性污染对结果的影响。
2.操作过程中应严格遵守无菌技术，以防细菌污染。
3.在制备样品溶液时，要正确配制缓冲液，以保持所需的pH值。
4.盐析实验过程中，应密切观察样品的混浊度变化，并根据需要调整盐浓度。
5.沉淀物的收集和洗涤过程应注意操作的轻柔，以避免蛋白质丢失。
6.在沉淀物的溶解过程中，可以适当调整溶解缓冲液的温度和时间，以获得最佳的溶解效果。
7.在进行蛋白质纯化时，可以根据需要选择合适的纯化方法，以去除杂质并提高纯度。
蛋白质样品的制备
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜,使细胞内容物释放出来. 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中,进行
悬浮处理.
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解. 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞. 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中.
⑴ 硫酸铵沉淀 盐析
原理：在高盐溶液中,蛋白倾向于聚合,并从溶液中沉淀下
来.许多潜在的杂质如核酸将保持在溶液中.
步骤：蛋白浓度大于lmg/ml,缓冲液浓度大于50mmol/L,并 含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和,搅拌10-30min,通过离 心沉淀蛋白.
然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的,因此,这种方法 只能被用来预分离或富集蛋白.并且,残存的硫酸铵会干扰 IEF,必须被清除.
二、裂解技术
⑴ 裂解液的组成
裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂还原剂、 固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性
脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质,形成完全随机的构 象,使所有的离子基团暴露于溶液中硫脲的加入可以进 一步提高溶解度,特别是对膜蛋白
去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用 导致蛋白质聚合
3.消除各种细胞或组织混杂的影响
二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理
2.尽可能的提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处 于溶解状态,且制备方法应具有可重现性.
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶 抑制剂以防止蛋白的降解.
4.样品制备过程中,防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.加入尿素 后加温不要超过37 ℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白
蛋白提取及WB步骤
Western blot 实验1）蛋白裂解液的配制:Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。
我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2）蛋白样品制备（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。
（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。
3）蛋白浓度测定（Bradford法）试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。
取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。
管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液0 0 200 μl 1 ml1 5 195 μl 1 ml2 10 190 μl 1 ml3 15 185 μl 1 ml4 20 180 μl 1 ml5 25 175 μl 1 ml我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
植物蛋白质的样品制备原理
植物蛋白质的样品制备原理植物蛋白质样品的制备是分析植物蛋白质结构和功能的重要步骤。
样品制备的目标是从复杂的植物组织中提取纯化蛋白质，以便进一步的分析和研究。
植物蛋白质样品的制备包括以下步骤：样品收集与处理、细胞破碎与组织粉碎、蛋白质提取与纯化。
下面将详细介绍每个步骤。
1. 样品收集与处理：首先选择合适的植物材料作为样品，如叶片、种子、根等。
材料选择应基于研究目的和研究对象。
收集到的样品应尽快进行处理，以防止样品中蛋白质的降解。
如果样品无法立即处理，应冷冻保存以保持蛋白质的完整性。
2. 细胞破碎与组织粉碎：首先将植物材料浸泡在冷冻的提取缓冲液中，常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液等，用于保护蛋白质的稳定性和活性。
然后将浸泡的植物材料用搅拌器或高压破碎器等工具进行细胞破碎和组织粉碎。
细胞破碎的目的是破坏细胞壁和细胞膜，释放细胞质中的蛋白质。
3. 蛋白质提取与纯化：经过细胞破碎和组织粉碎后，植物材料中的蛋白质被释放到提取缓冲液中。
接下来，通过离心和滤液等操作对杂质进行去除，得到含有蛋白质的提取液。
对于水溶性蛋白质，可以直接进行纯化。
一种常用的方法是利用蛋白质亲和层析技术，如亲和柱层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
这些方法基于蛋白质与特定分子之间的特异性相互作用，能够高效地纯化蛋白质。
另外，对于膜蛋白质和疏水性蛋白质，常采用溶剂萃取和洗脱的方法进行提取和纯化。
溶剂萃取常用有酸醇法、酸醚法、有机溶剂法等，通过膜的条件选择和撷取技术，将膜蛋白质从细胞膜中萃取出来。
洗脱方法包括弱酸洗脱、强碱洗脱和有机溶剂洗脱等，通过改变pH值、离子强度和洗脱溶剂的性质等条件，实现对蛋白质的分离纯化。
需要注意的是，由于植物组织中含有大量的非蛋白质成分，如多酚类、黄酮类、脂类等，这些物质在蛋白质提取和纯化过程中会产生干扰。
因此，在选择提取缓冲液和纯化方法时要考虑到样品的特性和目标蛋白质的性质，以避免对目标蛋白质的损伤和丢失。
WB实验步骤
附录一Western blotting实验步骤1．组织总蛋白样品制备：取适量组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。
将组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清，样品分装冻存于-20℃备用。
细胞总蛋白样品制备：对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 ul细胞总蛋白提取试剂（在使用前数分钟内加入cooktail+磷酸化蛋白酶抑制剂），振荡。
对于贴壁细胞：用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2 .测定蛋白浓度：2.1 按50：1配置BCA工作液。
2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。
2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。
2.4 分别加PBS定容至20ul。
2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。
，依标准曲线算出蛋白浓度。
2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A5623 SDS-PAGE电泳：3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。
同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。
蛋白电泳样品制备
蛋白电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，用于研究蛋白质的分子量、电荷和纯度等特性。
蛋白电泳样品的制备包括以下几个基本步骤：
样品提取：根据需要研究的蛋白质来源，选择合适的提取方法。
常用的提取方法包括机械破碎、化学提取和生物化学方法等。
确保样品提取得到足够纯净的蛋白质溶液。
样品预处理：根据需要去除样品中的其他杂质，如细胞碎片、核酸、脂质等。
可以使用蛋白质溶解剂、洗涤缓冲液、热处理等方法进行样品预处理。
蛋白质浓度测定：使用合适的方法测定蛋白质样品的浓度，以确保加样量的准确性和一致性。
常用的测定方法包括Bradford法、Lowry法、BCA法等。
添加蛋白质加载缓冲液：为了保持样品的稳定性和在电泳过程中获得更好的分离效果，将蛋白质样品与加载缓冲液混合。
加载缓冲液一般包含Tris-HCl缓冲液、甘氨酸、尿素、SDS等。
热处理和还原：对于某些样品，可以进行热处理和还原以助于蛋白质的解聚和线性化。
常见的热处理方法是将样品加热至95℃-100℃，常用的还原剂为二巯基乙酸（DTT）或巯基乙醇（β-ME）。
加载样品：将经过处理的蛋白质样品按照所需电泳装置的规格和要求加载到准备好的凝胶中，常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺浓缩凝胶（Native PAGE）。
以上步骤仅为一般流程，具体的样品制备方法和步骤可能因蛋白质的来源和实验目的而有所不同。
在进行蛋白电泳实验前，建议参考相关的实验方法和文献，以确保样品制备的准确性和可重复性。
蛋白质提取纯化的基本流程
蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。
为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。
蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。
下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释：### **1. 样品制备：**蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。
这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。
样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。
常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。
制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。
### **2. 裂解（细胞破碎）：**样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。
裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。
同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。
### **3. 离心：**裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。
离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。
上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。
### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：**层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。
这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。
常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。
### **5. 电泳：**电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。
在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。
蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。
常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
### **6. 检测和分析：**在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。
蛋白质样品制备教案：使用BCA法测定蛋白质浓度
蛋白质样品制备教案：使用BCA法测定蛋白质浓度蛋白质是构成生物体的基本物质之一，是细胞内一种重要的有机物质，对生命体系中的生长、发育、新陈代谢等过程都起着重要的作用。
因此，蛋白质的浓度是衡量一种生物体或细胞状态的重要指标之一。
测定蛋白质浓度是生物学实验中常见的基础工作之一。
本文将介绍一种常用的蛋白质样品制备教案：使用BCA法测定蛋白质浓度。
一、实验原理BCA法测定蛋白质浓度是通过一种化学反应来实现。
在碱性条件下，Cu2+被还原成Cu1+，同时，蛋白质中的蛋白氨基酸会与还原后的Cu1+形成紫色络合物。
通过比色法测定这种络合物的吸光度，可以计算得到蛋白质的浓度。
二、实验材料1. BCA标准蛋白质溶液2. BCA工作液：将A、B两液体按照1:50的比例混合制得3. 待测蛋白质样品4. 洗涤液：1%的十二烷基硫酸钠溶液5. NaOH溶液6. 96孔板及吸光度计7. 空心针头和移液枪8. 加热器和恒温槽三、实验步骤1. 制备标准曲线1）将BCA标准蛋白质溶液按照0.1-1.0mg/mL的浓度分别稀释成10个不同浓度的样品，每个样品分别加入50μL BCA工作液（预先加热至37°C）中；2）在空白孔中加入50μL BCA工作液，作为零点对照；3）在96孔板中加入200μL洗涤液，并稍微震荡混合均匀，然后排出洗涤液；4）将50μL各个样品和0μL控制液共同加入96孔板的每个相应孔中，混合均匀并于25°C加热反应60分钟；5）在60分钟后加入50μL NaOH溶液，在37°C恒温槽中静置15分钟；6）使用吸光度计检测吸光度，取得吸光度的标准曲线。
2. 测定待测样品1）将待测样品制备成与标准曲线中某个浓度相同的体积，然后加入50μL BCA工作液进行反应；2）按照上述第1步骤中的洗涤处理方法进行处理；3）检测吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度；4）根据实验需要，可以将样品进行稀释，再次进行测定。
蛋白样品制备方法步骤
蛋白样品制备方法步骤嘿，朋友们！今天咱们就来好好唠唠蛋白样品制备这事儿。
这可就像是一场美食烹饪大赛，不过咱的“食材”是蛋白质，要把它们准备得妥妥当当，后续的研究才能顺利进行呢。
咱先得明确一点，蛋白样品的来源那是多种多样的。
可能是从细胞里来的，也可能是从组织里提取的。
如果是从细胞里弄蛋白样品，这就有点像从一个热闹的小社区里找特定的居民。
首先得把细胞收集起来。
这时候就会用到像胰蛋白酶这样的“小助手”。
你想啊，细胞们就像住在公寓里的住户，胰蛋白酶就像是管理员，告诉大家“嘿，该搬家啦”，然后细胞就从培养瓶的壁上脱落下来了。
这收集细胞的过程可得小心翼翼的，就像捧着易碎的宝贝。
要是不小心把细胞弄破了，那里面的蛋白可能就乱套了，就像你把一整盒整齐摆放的乐高积木一下子打翻了一样糟糕。
收集好了细胞，接下来就是裂解细胞释放蛋白啦。
这就像是打开装满宝藏的箱子。
裂解液是关键，它就像一把万能钥匙。
一般的裂解液里面会有各种成分，比如去污剂。
这去污剂啊，就像一群勤劳的小清洁工，把细胞的膜结构给瓦解掉，这样蛋白就能跑出来了。
我有个朋友啊，刚开始做这个的时候，裂解液的量加得不对，结果呢？蛋白没释放完全，就像只捞出了半桶鱼，剩下的都还在池塘里呢，那实验结果能好才怪呢。
如果是从组织里提取蛋白样品，那又有点不同啦。
拿到组织之后，首先要做的就是把组织给切碎。
这时候你可以想象自己是个大厨，把一块肉切成小块。
这个过程也得小心，可不能切得太碎或者太粗。
太碎了可能会把蛋白破坏掉，太粗了呢，裂解就不充分。
有一回我在实验室，看到一个新手在切组织，那下手可没个准头，我就忍不住喊：“嘿，你这切得跟砍柴似的，蛋白都要被你砍坏啦！”切好之后，同样是用裂解液来处理，把蛋白从组织的小角落里都给揪出来。
不管是细胞还是组织，裂解完之后呢，就得到了一个混合着蛋白和其他杂质的溶液。
这时候就像一锅大杂烩，我们得把蛋白给提纯出来。
离心这个操作就登场了。
离心机一转起来，就像一个超级大力士在用力甩动这个大杂烩锅，密度大的杂质就被甩到下面去了，蛋白就留在上面的溶液里。
蛋白样本制备实验报告
蛋白样本制备实验报告摘要本实验旨在研究蛋白样本的制备方法，以提高蛋白质分析的准确性和稳定性。
通过使用不同的制备方法，我们比较了不同条件下蛋白样本的纯度、活性以及稳定性，并探讨了不同制备方法对蛋白质结构和功能的影响。
实验结果显示，适当的蛋白样本制备方法可以显著提高样本的纯度和稳定性，为后续的蛋白质分析提供更可靠的数据基础。
引言蛋白质是生命体内重要的功能分子，对于了解生物过程和疾病机制具有重要意义。
然而，由于蛋白质的复杂性和多样性，其分离纯化和分析并不容易。
蛋白样本的制备是蛋白质分析的第一步，直接影响后续的实验结果。
因此，选择合适的制备方法对于蛋白质研究至关重要。
材料与方法材料- 细胞培养基及培养器具- 细胞裂解液- 细胞膜孔裂解试剂- 蛋白质纯化柱- SDS-PAGE凝胶- 蛋白质标记和检测试剂方法1. 细胞培养和裂解：选取合适的细胞培养基，培养细胞至对数生长期。
使用细胞裂解液或细胞膜孔裂解试剂裂解细胞，获得总细胞蛋白裂解液。
2. 蛋白质纯化：将裂解液经过离心或过滤，除去细胞碎片和大分子杂质。
将样品通过蛋白质纯化柱进行纯化，去除非目标蛋白质。
3. 洗脱和浓缩：使用适当的洗脱缓冲液，将目标蛋白质从柱上洗脱并收集。
对洗脱液进行浓缩，得到纯化的蛋白样本。
4. SDS-PAGE分析：将蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，根据分子量大小判断蛋白样本的纯度和完整性。
5. 蛋白质标记和检测：对蛋白样本进行标记，并选择合适的方法进行检测。
结果与讨论通过使用不同的制备方法，我们对比了不同条件下蛋白样本的纯度、活性和稳定性。
首先，我们比较了细胞裂解液和细胞膜孔裂解试剂两种裂解方法的效果。
结果显示，使用细胞裂解液裂解的蛋白样本纯度较高，且蛋白质结构更为稳定。
而细胞膜孔裂解试剂对细胞膜的破坏较大，导致蛋白质的结构和活性丧失较多。
其次，我们进行了不同纯化条件下的比较。
结果显示，蛋白质纯化柱可以有效去除非目标蛋白质，提高样本的纯度。
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双向电泳之样品的制备2008-04-02 21:58:37| 分类：默认分类|举报|字号订阅一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。
目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。
当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。
通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。
在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。
样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。
脂类和多糖都可以通过超速离心除去。
透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。
样品制备程序：⒈培养细胞（culture cell）样品处理方法：培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。
裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％Pharmalyte pH 3-10.其他常用的裂解缓冲液如下：(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabl℃proteinase inhibitor;(C) 加入0.3 -1% SDS 在95 ℃煮样品5mins ，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。
总蛋白抽提程序：（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS；（4）加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100µL 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5）4℃，40,000g，离心1h；（6）吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃备用。
组织样品处理方法：对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。
但遵循的原则基本相同。
下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。
三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：（1）在液氮中研碎叶片；（2）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%ß-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20 ℃的冰浴；（3）让蛋白质沉淀过夜然后离心（4℃，40,000g, 1h），弃上清；（4）重悬沉淀浮于含0.07%β -巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；（5）离心（4℃，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；（6）用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4℃，40,000g, 1h）。
Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer DLysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA anda cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 µL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT,25% v/v glycerol注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
其中C-F 是分步法提取的4 种裂解液配方, C 适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F 适于提取难溶的沉淀蛋白。
阅读(326)|评论(0)蛋白质组研究第一步：双向电泳蛋白样品制备[选购宝典]【字体：大中小】 时间：2006年02月13日来源：生物通摘要：在直击蛋白质组学研究技术全过程一文中就提到过，目前蛋白质组学研究主要是两条互补的实验工作流程——基于凝胶的工作流程（Gel-based workflow）和基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）。
其中对于前者而言，双向电泳技术是核心，而这核心中的核心就是电泳的第一步：蛋白样品制备。
这是因为不像双向电泳的其它过程有仪器，有大致相似的操作程序，蛋白样品由于其结构特性各异，又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰，所以不可能有一个通用的技术，只能通过大量的实验来积累经验。
正如开篇所引用的两句话中包含的深意：在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性，也需要将其看成是独特而奇妙的个体，结合以往经验但又不拘泥于经验，才能真正揭开她神秘的面纱。
为什么要进行样品制备“为什么要进行样品制备？电泳的目的不就是分离吗？”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。
这个问题很好回答，这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此样品的制备是必须的。
另外比如像对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的，由于临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。
所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型，因此需要进行有效的样品制备。
但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢？这不仅仅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法来配合，而且在制备样品的时候，首先需要明确的是什么是实验的最终目的：是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白，这些直接决定了你的制备方法，也决定了实验的成功与否。
由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的，溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成，因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣，可采取预分离的方法，如欲分析的蛋白来自细胞器（细胞核、线粒体和原生质膜），则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白；如果是希望分离出尽可能多的蛋白，比如进行全蛋白质组分析，则可以将细胞或组织中的蛋白分成几部分，分级制备。
样品制备的原则1.应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
2.防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
3.防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。
4.完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
5.尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。
以上这五项原则是根据北大人类疾病研究中心讲座内容改编而来，基本上可以说是囊括了样品制备过程中的抽象注意事项，之后还会提到具体的注意事项。
样品制备流程蛋白样品制备过程简而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除杂质。
虽然说出来不过寥寥的十个字，但是这几个过程经过这么多年，还没有那位研究人员可以说自己已经完全掌握，面对任何蛋白制备手到擒来。
破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则样品制备的第一步当然是细胞或者其它样品的破碎，这一步看似简单，但是操作中一旦方法不当，就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。
要想毫发无损的通过这一关，首先就要分析样品的来源，是易碎的细胞还是坚硬的组织？是植物细胞还是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。
破碎的方法有许多种，包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等（可以归纳为机械法、化学法和物理法），这些方法有不同的应用范围，但基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解，这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。
就这些方法具体而言，选择的时候如果是较易破碎的细胞组织，就可以采用渗透法，这种方法十分温和，适用于血细胞和组织培养细胞。
而对于细菌细胞，则可以采用冻融法，利用液氮一次或者多次反复冻融来裂解细胞。
去污剂法适用于组织培养细胞，将样品悬浮于含有去污剂的裂解液中，可以溶解细胞膜释放内含物，如果裂解液中含有SDS，为了不干扰等电聚焦，可以将裂解的样品用含有过量的非离子或者两性离子去污剂的溶液稀释，或用丙酮沉淀法去除SDS。
另外酶裂解法适用于植物组织、细菌和真菌细胞。
除了这几种较温和的方法，一些较剧烈的方法也有自己的适用范围，如超声波法适用于细胞悬浮液，高压法常用于有细胞壁的微生物，研磨法适用于微生物和组织，而机械匀浆法是机体软组织破碎最常用的方法之一，玻璃珠破碎法则用于细胞悬浮液和微生物的破碎。
为了确保在这些方法过程中减少热量的产生，可以在低温（冰浴或者液氮）下操作，并且由于在破碎过程中会产生蛋白酶，使蛋白水解，因此也要注意在含有蛋白酶抑制剂的裂解液中进行。