蛋白质样品的制备
蛋白质分离纯化的注意事项
蛋白质分离纯化的注意事项蛋白质分离纯化是生物学和生物化学研究中常用的一个步骤，它用于将混合的蛋白质溶液中的目标蛋白质分离出来并去除杂质。
蛋白质分离纯化的注意事项有很多，下面将详细介绍。
1. 样品的制备：蛋白质的分离纯化前，首先需要对样品进行合适的制备。
采集样品时要避免污染、破坏或降解蛋白质。
样品的pH、温度和离心速度等因素对蛋白质的稳定性有重要影响，因此需要根据实验需要进行适当的处理。
2. 分离纯化方法的选择：根据不同的蛋白质性质和研究目的，选择合适的分离纯化方法。
常用的方法包括离心法、沉淀法、过滤法、电泳法、层析法等。
在选择方法时要考虑到分离纯化的效果、时间、成本、操作难度等因素。
3. 分离纯化条件的优化：在选择分离纯化方法后，需要对实验条件进行优化。
例如，选择合适的缓冲液和pH，优化温度和离心速度，调整柱层析的流速和梯度，以及优化电泳条件等。
优化条件可以提高蛋白质的分离纯化效果。
4. 对蛋白质的保存和稳定性需小心处理：蛋白质容易受到温度、pH、氧化和降解等因素的影响而失活。
因此，在整个分离纯化的过程中，要注意进行低温处理，避免酶的降解和氧化反应的发生。
此外，还可以使用蛋白质稳定剂，如甘油、蔗糖或明胶等，来延长蛋白质的保存时间。
5. 删除杂质的步骤：蛋白质分离纯化的一个重要目标是去除杂质。
去除杂质的方法包括胶体沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、离心沉淀等。
选择适当的去除杂质的方法，能够提高分离纯化的纯度。
6. 纯化后的保存：在完成蛋白质的分离纯化后，必须妥善保存纯化蛋白质。
纯化蛋白质容易受到冻融循环、氧化和结构变化等因素的影响，因此需要在低温下保存，并加入适当的保护剂以避免降解。
7. 纯度和活性的鉴定：对于蛋白质分离纯化后的样品，需要进行纯度和活性的鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting、质谱分析、酶活分析等。
这些鉴定方法能够确定纯化蛋白质的纯度和活性，从而确定分离纯化的效果是否达到预期目标。
蛋白质的十种提取方法
蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择；而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。
男人因沧桑而成熟，女人因成熟而沧桑。
男人有了烟，有了酒，也就有了故事；女人有了钱，有了资色，也就有了悲剧。
蛋白质提取方法-------列举10种方法[ 来源：绿谷生物网点击数： 4587 更新时间： 2008年05月30日 ][ 收藏本文 ] 一、植物组织蛋白质提取方法（summer）1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法 (summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜（newinbio）目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000 g，10min，4度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次沉淀中加入100％乙醇 2ml充分振荡混匀，置室温20 min离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。
下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。
1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。
样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。
在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。
2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。
通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。
常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。
3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。
裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。
常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。
4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。
常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。
5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。
常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。
常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。
以上就是提取蛋白质的具体步骤。
通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。
希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。
提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。
下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。
1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。
样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。
2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。
常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。
3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。
蛋白质质谱样品制备步骤
蛋白质质谱样品制备步骤
蛋白质质谱样品制备步骤如下：
蛋白质破碎：根据细胞或组织类型的不同，选择不同的破碎方法。
常用的破碎方法包括液氮研磨、超声破碎、反复冻融、机械匀浆等。
蛋白沉淀：在破碎后的溶液中加入蛋白质沉淀剂，使蛋白质沉淀析出。
常用的蛋白质沉淀剂包括丙酮、甲醇、乙醇等。
洗涤：去除沉淀物中的杂质，如盐分、糖类等。
常用的洗涤液为低浓度的有机溶剂或缓冲液。
干燥：将洗涤后的蛋白质沉淀物干燥，以便进行后续的质谱分析。
常用的干燥方法包括冷冻干燥和真空干燥。
酶解：将干燥后的蛋白质沉淀物进行酶解，将其分解成肽段。
常用的酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶。
肽段分离：将酶解后的肽段进行分离纯化，以便进行后续的质谱分析。
常用的分离方法包括凝胶电泳、色谱技术等。
标记：对分离纯化后的肽段进行标记，以便在质谱分析时进行定量和鉴定。
常用的标记方法包括同位素标记、化学荧光标记等。
质谱分析：将标记后的肽段进行质谱分析，测定其分子量和序列信息。
常用的质谱仪有MALDI-TOF、ESI-MS等。
通过以上步骤，可以制备出适合进行蛋白质质谱分析的样品，为后续的蛋白质鉴定和功能研究提供基础。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白质谱对样品的要求
蛋白质谱对样品的要求质谱技术是蛋白质组学研究中的重要技术，可以实现多种蛋白质分析。
进行蛋白质质谱分析首先要制备合适的样品，样品的好坏程度与实验结果的准确度息息相关，很多小伙伴在问蛋白质质谱样品怎么准备、需要多少量等，这次小编就从样本类型、样本含量以及其他注意事项三个方面给大家介绍一下蛋白质质谱分析中样品制备相关的内容。
一、蛋白样本类型：可以用于质谱分析的蛋白样本类型很多，包括动植物/微生物细胞或细胞裂解液、动植物组织、体液样品如血清/血浆/尿液等、蛋白胶条/胶点以及Pull down/Co-IP/IP蛋白样本等。
二、不同的蛋白质样本的含量需求如下表所示：样本。
类型。
蛋白溶液。
细胞。
动物常规组织。
植物常规组织。
细菌与真菌菌体。
胶点胶条、Pull down/Co-IP/IP蛋白样本。
用量。
50ug。
(2ug/ul)。
1*107/(50ul细胞沉淀)。
100mg。
0.1-2g。
100mg/100ul。
胶条大小以1cm*1cm大小为宜，蛋白含量不低于20ug。
三、其他注意事项：1、对于蛋白质溶液样本需提供溶剂的试剂成分；2、若样品中含有毒性或腐蚀性的物质，必须事先声明；3、一些病原性的微生物或具有侵染性的病变组织需进行灭活；4、用银染法进行蛋白胶染色时，应选择与质谱分析兼容的试剂，银染的样本不能进行脱色。
综上可知，制备蛋白质质谱样品没有一个固定或统一的方法，应根据具体的实验目的和质谱分析的要求进行样本制备，在样本制备过程中应遵循准确记录、迅速低温的原则，最大限度的缩短样本采集到实验的时间，避免蛋白质发生降解。
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蛋白质sdspage电泳实验报告
蛋白质sdspage电泳实验报告蛋白质SDS-PAGE电泳实验报告引言：蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。
为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们开发了许多技术和方法。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳的方式将蛋白质按照其分子量大小进行分离和定量。
实验目的：本实验旨在通过SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质进行分析，了解其分子量和纯度，并探讨其应用于蛋白质研究中的意义。
实验步骤：1. 样品制备：收集不同来源的蛋白质样品，如乳清蛋白、鸡蛋清蛋白等。
将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液中，加热至100摄氏度，使蛋白质完全变性。
2. 准备电泳胶：根据实验需要，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，加入TEMED和过硫酸铵使其聚合。
3. 装载样品：将变性后的蛋白质样品注入电泳胶槽中，注意不要产生气泡。
4. 电泳：将电泳胶槽连接至电源，设置合适的电压和时间，进行电泳分离。
5. 凝胶染色：将电泳胶取出，用凝胶染色剂染色，使蛋白质带可见。
6. 图像分析：使用分子量标准品作为参照，通过图像分析软件测量蛋白质带的迁移距离，计算其分子量。
实验结果：通过SDS-PAGE电泳实验，我们成功地将不同来源的蛋白质样品分离出来，并得到了清晰的蛋白质带。
根据分子量标准品的迁移距离，我们计算出了各个蛋白质样品的分子量。
讨论：1. 分子量测定：通过SDS-PAGE电泳实验，我们可以准确地测定蛋白质的分子量。
这对于研究蛋白质的结构和功能非常重要，因为不同分子量的蛋白质可能具有不同的生物活性和相互作用方式。
2. 纯度分析：通过观察电泳胶上的蛋白质带的清晰度和数量，我们可以初步评估样品的纯度。
纯度高的样品通常只有一个清晰的蛋白质带，而纯度低的样品则可能有多个模糊的带。
因此，SDS-PAGE电泳可以帮助我们选择纯度较高的蛋白质样品进行后续实验。
3. 应用前景：SDS-PAGE电泳技术在生物医学研究中有着广泛的应用前景。
蛋白盐析实验步骤及注意事项
蛋白盐析实验步骤及注意事项蛋白盐析是一种用于分离和纯化蛋白质的实验方法。
下面是蛋白盐析实验的步骤及注意事项：步骤一：样品制备1.首先，准备蛋白样品。
可以从细胞裂解物、组织提取物或培养物中获取蛋白样品。
2.制备适量的样品溶液，添加必要的缓冲剂，以调节溶液pH值，并使其适应盐析条件。
步骤二：筛选适宜的沉淀剂1.准备一系列不同盐浓度的盐溶液。
常用的盐包括氯化铵、硫酸铵等。
2.在实验过程中，可以通过比较不同盐溶液对蛋白沉淀效果的差异来确定最适宜的沉淀剂。
步骤三：盐析实验1.向样品溶液中加入适量的盐溶液，使盐浓度逐渐增加。
2.搅拌样品溶液，促进蛋白质和盐的相互作用。
3.观察样品的混浊度变化。
盐的加入会引起蛋白质沉淀，形成白色沉淀物。
4.根据样品中蛋白质的特性调整盐浓度，以达到最佳分离效果。
步骤四：沉淀物的收集1.当混浊度降低到一定程度时，停止盐的加入。
2.用离心机将样品离心，使蛋白质沉淀于离心管底部。
3.倒掉上清液，保留沉淀物。
步骤五：沉淀物的洗涤1.向沉淀物中加入适量的洗涤缓冲液，搅拌，让沉淀物重新悬浮。
2.离心样品，倒掉液体，保留沉淀物。
3.重复上述洗涤步骤，以去除残留的盐和杂质。
步骤六：沉淀物的溶解1.向沉淀物中加入适量的溶解缓冲液，用于溶解蛋白质。
2.搅拌样品溶液，在适当的温度和时间下，使蛋白质完全溶解。
步骤七：纯化蛋白质1.将溶解的蛋白质样品进行进一步的纯化方法，如色谱法、电泳法等。
注意事项：1.在整个实验过程中，应注意实验室的清洁卫生，防止外源性污染对结果的影响。
2.操作过程中应严格遵守无菌技术，以防细菌污染。
3.在制备样品溶液时，要正确配制缓冲液，以保持所需的pH值。
4.盐析实验过程中，应密切观察样品的混浊度变化，并根据需要调整盐浓度。
5.沉淀物的收集和洗涤过程应注意操作的轻柔，以避免蛋白质丢失。
6.在沉淀物的溶解过程中，可以适当调整溶解缓冲液的温度和时间，以获得最佳的溶解效果。
7.在进行蛋白质纯化时，可以根据需要选择合适的纯化方法，以去除杂质并提高纯度。
western原理及主要步骤
western原理及主要步骤Western原理及主要步骤Western原理是一种常用的蛋白质分析方法，通过电泳分离蛋白质并使用特定的抗体进行检测，从而可以定性和定量地分析目标蛋白质的表达水平。
本文将介绍Western原理的基本概念和主要步骤。
一、Western原理的基本概念Western原理是基于免疫学的方法，通过将蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺凝胶（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性抗体结合，再用次级抗体标记的酶或荧光物质进行检测。
通过观察标记物的产生或荧光信号的强度，可以得出目标蛋白质的表达水平。
二、Western的主要步骤1. 蛋白质样品的制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质样品。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆和切片等。
提取的样品需要添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
2. SDS-PAGE电泳分离：将蛋白质样品与含有SDS和还原剂的样品缓冲液混合，使蛋白质变性并带负电荷。
然后，将混合物注入到聚丙烯酰胺凝胶的孔中，通过电场作用使蛋白质在凝胶中分离。
较小的蛋白质会移动得更快，而较大的蛋白质则移动得更慢。
3. 蛋白质迁移：将分离的蛋白质从凝胶上转移到PVDF或硝酸纤维素膜上。
这一步骤称为蛋白质的迁移或转印。
迁移可以使用湿式或半干式电泳转印系统进行。
4. 阻断和抗体结合：在蛋白质迁移膜上，需要进行阻断以防止非特异性结合。
常用的阻断剂有牛血清蛋白、非脂干奶粉和BSA等。
然后，将特异性抗体与目标蛋白质结合。
5. 检测和显色：使用次级抗体标记的酶或荧光物质，与结合了特异性抗体的蛋白质结合。
常用的次级抗体有HRP（辣根过氧化物酶）和AP（碱性磷酸酶）。
酶标法中，通过添加底物，可以使酶产生产生可见的颜色。
荧光法中，通过激发物质的激发光源，观察蛋白质所产生的荧光信号。
6. 图像分析：使用相应的成像系统记录酶标法的显色结果或荧光法的荧光信号。
sds page凝胶电泳步骤
sds page凝胶电泳步骤以SDS-PAGE凝胶电泳步骤为标题的文章SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测量方法，其步骤包括蛋白质样品的制备、样品加载、电泳运行、染色和图像分析等。
本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳的步骤及相关注意事项。
一、蛋白质样品的制备准备要分离的蛋白质样品，并将其加入样品缓冲液中，以使蛋白质溶解并保持其天然构象。
样品缓冲液通常包含Tris-HCl缓冲液、甘油、SDS和β-巯基乙醇等成分，用于维持样品的pH值和还原环境，使蛋白质完全展开。
二、样品加载将制备好的蛋白质样品加载到凝胶孔中。
通常使用微量吸管或微量注射器将样品缓冲液缓慢地注入凝胶孔中，确保样品完全进入凝胶中。
三、电泳运行将已加载样品的凝胶板放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。
然后将电泳槽连接到电源，并设置合适的电压和电流参数。
根据需要，可以选择常规电泳或快速电泳。
在电泳过程中，蛋白质样品会在凝胶中被电场推动，根据其分子大小和电荷不同，被分离成不同的带状条带。
较小的蛋白质分子迁移速度较快，而较大的蛋白质分子迁移速度较慢。
四、染色电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质带状条带。
常用的染色方法有银染色和Coomassie蓝染色。
银染色对蛋白质敏感性高，但操作繁琐；而Coomassie蓝染色操作简单，但对蛋白质敏感性相对较低。
五、图像分析通过使用分析软件或图像扫描仪，将染色后的凝胶图像数字化，并进行分析。
可以测量蛋白质带状条带的相对迁移距离和相对强度，进而确定蛋白质的分子大小和相对丰度。
在进行SDS-PAGE凝胶电泳实验时，还需要注意以下事项：1. 准备工作确保操作台和仪器干净，并准备好所需的试剂和设备。
避免在实验过程中发生交叉污染。
2. 样品加载在加载样品时，应避免空气泡和溢出。
确保样品均匀地加载到凝胶孔中，以获得清晰的带状条带。
3. 电泳运行条件根据蛋白质样品的大小和分离需求，选择合适的电压和电流参数。
蛋白质样品的制备
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜,使细胞内容物释放出来. 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中,进行
悬浮处理.
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解. 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞. 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中.
⑴ 硫酸铵沉淀 盐析
原理：在高盐溶液中,蛋白倾向于聚合,并从溶液中沉淀下
来.许多潜在的杂质如核酸将保持在溶液中.
步骤：蛋白浓度大于lmg/ml,缓冲液浓度大于50mmol/L,并 含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和,搅拌10-30min,通过离 心沉淀蛋白.
然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的,因此,这种方法 只能被用来预分离或富集蛋白.并且,残存的硫酸铵会干扰 IEF,必须被清除.
二、裂解技术
⑴ 裂解液的组成
裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂还原剂、 固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性
脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质,形成完全随机的构 象,使所有的离子基团暴露于溶液中硫脲的加入可以进 一步提高溶解度,特别是对膜蛋白
去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用 导致蛋白质聚合
3.消除各种细胞或组织混杂的影响
二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理
2.尽可能的提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处 于溶解状态,且制备方法应具有可重现性.
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶 抑制剂以防止蛋白的降解.
4.样品制备过程中,防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.加入尿素 后加温不要超过37 ℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
第二章蛋白质样品的制备
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
⑸ 甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
植物蛋白质的样品制备原理
植物蛋白质的样品制备原理植物蛋白质样品的制备是分析植物蛋白质结构和功能的重要步骤。
样品制备的目标是从复杂的植物组织中提取纯化蛋白质，以便进一步的分析和研究。
植物蛋白质样品的制备包括以下步骤：样品收集与处理、细胞破碎与组织粉碎、蛋白质提取与纯化。
下面将详细介绍每个步骤。
1. 样品收集与处理：首先选择合适的植物材料作为样品，如叶片、种子、根等。
材料选择应基于研究目的和研究对象。
收集到的样品应尽快进行处理，以防止样品中蛋白质的降解。
如果样品无法立即处理，应冷冻保存以保持蛋白质的完整性。
2. 细胞破碎与组织粉碎：首先将植物材料浸泡在冷冻的提取缓冲液中，常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液等，用于保护蛋白质的稳定性和活性。
然后将浸泡的植物材料用搅拌器或高压破碎器等工具进行细胞破碎和组织粉碎。
细胞破碎的目的是破坏细胞壁和细胞膜，释放细胞质中的蛋白质。
3. 蛋白质提取与纯化：经过细胞破碎和组织粉碎后，植物材料中的蛋白质被释放到提取缓冲液中。
接下来，通过离心和滤液等操作对杂质进行去除，得到含有蛋白质的提取液。
对于水溶性蛋白质，可以直接进行纯化。
一种常用的方法是利用蛋白质亲和层析技术，如亲和柱层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
这些方法基于蛋白质与特定分子之间的特异性相互作用，能够高效地纯化蛋白质。
另外，对于膜蛋白质和疏水性蛋白质，常采用溶剂萃取和洗脱的方法进行提取和纯化。
溶剂萃取常用有酸醇法、酸醚法、有机溶剂法等，通过膜的条件选择和撷取技术，将膜蛋白质从细胞膜中萃取出来。
洗脱方法包括弱酸洗脱、强碱洗脱和有机溶剂洗脱等，通过改变pH值、离子强度和洗脱溶剂的性质等条件，实现对蛋白质的分离纯化。
需要注意的是，由于植物组织中含有大量的非蛋白质成分，如多酚类、黄酮类、脂类等，这些物质在蛋白质提取和纯化过程中会产生干扰。
因此，在选择提取缓冲液和纯化方法时要考虑到样品的特性和目标蛋白质的性质，以避免对目标蛋白质的损伤和丢失。
western实验步骤
western实验步骤Western实验步骤西方实验法（Western blotting）是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来检测目标蛋白在复杂混合物中的存在以及其相对丰度。
本文将介绍Western实验的步骤。
1. 样品制备需要从细胞或组织中提取蛋白质。
可以使用细胞裂解液或蛋白质提取缓冲液来裂解细胞，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，使用离心等方法将细胞碎片与其他细胞组分分离。
最后，将得到的蛋白质溶液进行浓缩和纯化，以获得高质量的蛋白样品。
2. SDS-PAGE电泳将样品中的蛋白质按照其分子量大小通过SDS-PAGE电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在加热后进行电泳。
电泳时，将样品注入凝胶孔中，并在电场作用下进行分离。
蛋白质在凝胶中的移动速度受到其分子量的影响，较小的蛋白质迁移得更远。
电泳结束后，用染色剂染色来可视化蛋白带。
3. 转膜将电泳后的蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便进行后续的免疫检测。
通常使用半干法或湿法转膜的方法。
在半干法中，将电泳片与膜和吸收纸堆叠在一起，用电流将蛋白质转移到膜上。
在湿法中，将电泳片和膜分别浸泡在缓冲液中，并通过电流进行转膜。
转膜完成后，可以通过Ponceau染色来验证转膜效果。
4. 阻断和抗体处理为了减少非特异性结合，需要在膜上进行阻断处理。
常用的阻断剂包括非脂类干乳或BSA。
将膜浸泡在阻断液中，以阻断未结合的蛋白质结合位点。
然后，将膜与目标蛋白特异性的一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验的目的和样品的特点来确定。
将膜与抗体孵育一段时间后，用缓冲液洗涤膜以去除未结合的一抗。
5. 二抗检测在处理完一抗后，需要使用与一抗来源物种不同的二抗来检测目标蛋白的存在。
二抗一般是与酶或荧光标记结合的抗体。
将膜与二抗进行孵育，并再次用缓冲液洗涤膜以去除未结合的二抗。
然后，使用适当的检测方法来可视化目标蛋白。
6. 结果分析根据实验目的和所用的检测方法，可以使用化学发光、荧光成像或酶标记等技术来检测和量化目标蛋白的存在。
蛋白质测定的实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质测定的原理和方法。
2. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
3. 通过实验，提高实验技能和数据分析能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能。
蛋白质的测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、比色法等。
本实验采用双缩脲法测定蛋白质含量。
双缩脲法基于蛋白质分子中的肽键与铜离子反应生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。
通过测定该络合物在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质含量。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、牛奶、豆奶等蛋白质样品。
2. 试剂：（1）双缩脲试剂A：称取硫酸铜0.1g，溶解于100ml蒸馏水中。
（2）双缩脲试剂B：称取酒石酸钾钠0.5g，溶解于100ml蒸馏水中，加入10g 氢氧化钠。
（3）标准蛋白质溶液：称取牛血清白蛋白0.1g，溶解于100ml蒸馏水中，配制成1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液。
四、实验仪器1. 电子天平2. 移液器3. 721分光光度计4. 烧杯5. 试管6. 滴管五、实验步骤1. 样品制备：取适量蛋白质样品，加入蒸馏水稀释至一定浓度。
2. 标准曲线绘制：分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液于试管中，加入2ml双缩脲试剂A，摇匀，静置2min。
然后加入2ml双缩脲试剂B，摇匀，静置2min。
以蒸馏水为空白，于540nm波长下测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：分别取0.2ml样品溶液于试管中，按照步骤2的操作进行测定。
以蒸馏水为空白，于540nm波长下测定吸光度。
4. 结果计算：根据标准曲线，计算样品中蛋白质含量。
六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据，绘制标准曲线，计算相关系数R²，验证标准曲线的线性关系。
2. 样品测定：根据标准曲线，计算样品中蛋白质含量，并与理论值进行比较。
蛋白质提取的方法和原理流程图
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蛋白质提取纯化的基本流程
蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。
为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。
蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。
下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释：### **1. 样品制备：**蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。
这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。
样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。
常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。
制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。
### **2. 裂解（细胞破碎）：**样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。
裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。
同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。
### **3. 离心：**裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。
离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。
上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。
### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：**层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。
这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。
常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。
### **5. 电泳：**电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。
在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。
蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。
常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
### **6. 检测和分析：**在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。
蛋白质样品制备教案：使用BCA法测定蛋白质浓度
蛋白质样品制备教案：使用BCA法测定蛋白质浓度蛋白质是构成生物体的基本物质之一，是细胞内一种重要的有机物质，对生命体系中的生长、发育、新陈代谢等过程都起着重要的作用。
因此，蛋白质的浓度是衡量一种生物体或细胞状态的重要指标之一。
测定蛋白质浓度是生物学实验中常见的基础工作之一。
本文将介绍一种常用的蛋白质样品制备教案：使用BCA法测定蛋白质浓度。
一、实验原理BCA法测定蛋白质浓度是通过一种化学反应来实现。
在碱性条件下，Cu2+被还原成Cu1+，同时，蛋白质中的蛋白氨基酸会与还原后的Cu1+形成紫色络合物。
通过比色法测定这种络合物的吸光度，可以计算得到蛋白质的浓度。
二、实验材料1. BCA标准蛋白质溶液2. BCA工作液：将A、B两液体按照1:50的比例混合制得3. 待测蛋白质样品4. 洗涤液：1%的十二烷基硫酸钠溶液5. NaOH溶液6. 96孔板及吸光度计7. 空心针头和移液枪8. 加热器和恒温槽三、实验步骤1. 制备标准曲线1）将BCA标准蛋白质溶液按照0.1-1.0mg/mL的浓度分别稀释成10个不同浓度的样品，每个样品分别加入50μL BCA工作液（预先加热至37°C）中；2）在空白孔中加入50μL BCA工作液，作为零点对照；3）在96孔板中加入200μL洗涤液，并稍微震荡混合均匀，然后排出洗涤液；4）将50μL各个样品和0μL控制液共同加入96孔板的每个相应孔中，混合均匀并于25°C加热反应60分钟；5）在60分钟后加入50μL NaOH溶液，在37°C恒温槽中静置15分钟；6）使用吸光度计检测吸光度，取得吸光度的标准曲线。
2. 测定待测样品1）将待测样品制备成与标准曲线中某个浓度相同的体积，然后加入50μL BCA工作液进行反应；2）按照上述第1步骤中的洗涤处理方法进行处理；3）检测吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度；4）根据实验需要，可以将样品进行稀释，再次进行测定。
蛋白样品制备方法步骤
蛋白样品制备方法步骤嘿，朋友们！今天咱们就来好好唠唠蛋白样品制备这事儿。
这可就像是一场美食烹饪大赛，不过咱的“食材”是蛋白质，要把它们准备得妥妥当当，后续的研究才能顺利进行呢。
咱先得明确一点，蛋白样品的来源那是多种多样的。
可能是从细胞里来的，也可能是从组织里提取的。
如果是从细胞里弄蛋白样品，这就有点像从一个热闹的小社区里找特定的居民。
首先得把细胞收集起来。
这时候就会用到像胰蛋白酶这样的“小助手”。
你想啊，细胞们就像住在公寓里的住户，胰蛋白酶就像是管理员，告诉大家“嘿，该搬家啦”，然后细胞就从培养瓶的壁上脱落下来了。
这收集细胞的过程可得小心翼翼的，就像捧着易碎的宝贝。
要是不小心把细胞弄破了，那里面的蛋白可能就乱套了，就像你把一整盒整齐摆放的乐高积木一下子打翻了一样糟糕。
收集好了细胞，接下来就是裂解细胞释放蛋白啦。
这就像是打开装满宝藏的箱子。
裂解液是关键，它就像一把万能钥匙。
一般的裂解液里面会有各种成分，比如去污剂。
这去污剂啊，就像一群勤劳的小清洁工，把细胞的膜结构给瓦解掉，这样蛋白就能跑出来了。
我有个朋友啊，刚开始做这个的时候，裂解液的量加得不对，结果呢？蛋白没释放完全，就像只捞出了半桶鱼，剩下的都还在池塘里呢，那实验结果能好才怪呢。
如果是从组织里提取蛋白样品，那又有点不同啦。
拿到组织之后，首先要做的就是把组织给切碎。
这时候你可以想象自己是个大厨，把一块肉切成小块。
这个过程也得小心，可不能切得太碎或者太粗。
太碎了可能会把蛋白破坏掉，太粗了呢，裂解就不充分。
有一回我在实验室，看到一个新手在切组织，那下手可没个准头，我就忍不住喊：“嘿，你这切得跟砍柴似的，蛋白都要被你砍坏啦！”切好之后，同样是用裂解液来处理，把蛋白从组织的小角落里都给揪出来。
不管是细胞还是组织，裂解完之后呢，就得到了一个混合着蛋白和其他杂质的溶液。
这时候就像一锅大杂烩，我们得把蛋白给提纯出来。
离心这个操作就登场了。
离心机一转起来，就像一个超级大力士在用力甩动这个大杂烩锅，密度大的杂质就被甩到下面去了，蛋白就留在上面的溶液里。
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4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
（二）、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
1. 超声裂解法
⑵ TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）
这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提 取液中，终浓度将高达10％-20 ％。蛋白质可于 冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10 ％-20 ％的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去TCA。 然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完 全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清 除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白 降解或修饰。
2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接臵裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。 蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
第一节
样品制备总则
一、为什么要进行蛋白质样品的制备 1.要从某些组织样品中寻找功能蛋白质，就 要排除非蛋白质的影响。 2.目前实验条件下，双向电泳能分辨到 1000-5000个蛋白质点（spot），而生物 的蛋白种类多达10万种以上，样品中的蛋 白质种类也可达到1万种以上，但大部分 蛋白质的拷贝数都很少，因此通过样品制 备也可以起到浓缩蛋白质的作用。 3.消除各种细胞或组织混杂的影响
⑵ 还原剂
还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基 之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用 的还原剂有β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或 二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常 用的是DTT。
⑶ 去污剂（表面活性剂）
去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作 用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作 用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和 兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂 SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两性离 子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或 者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移 位臵。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40和 TritonX-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离 子去污剂CHAPS的效果更好。
第二章 蛋白质样品的制备
蛋白质样品的制备是蛋白质组分析的基础 蛋白质样品制备包含：蛋白质分离、提取、纯化
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一 步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L， 作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但 是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。
⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA） 乙二醇双四乙酸（EGTA）
通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。
⑷ 肽蛋白酶抑制剂
二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理 2.尽可能的提高样品的溶解度，使所有待分析的蛋白质样品全部 处于溶解状态，且制备方法应具有可重现性。 3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白 酶抑制剂以防止蛋白的降解。 4.样品制备过程中，防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.（加 入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白) 5.防止样品在等电聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀 6.破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用，以产生独立的 多肽链 7.有的研究中必须保持蛋白质的活性。 8.通过超速冷冻离心等方法清除所有的非蛋白杂质，对可能起干 扰作用的高丰度或无关蛋白质也应去除 9.样品裂解液应该新鲜配臵，并且分装冻存于-80 ℃。勿反复冻 融已制备好的样品。
二、裂解技术
⑴ 裂解液的组成 裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂（还 原剂、固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性） 脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质，形成完全随机 的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中（硫脲的加 入可以进一步提高溶解度，特别是对膜蛋白） 去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作 用导致蛋白质聚合 还原剂：可以断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还 原状态。 载体两性电解质和固相PH梯度缓冲液也包含于裂解 液中：通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白质聚 合来增强其溶解性。
一、裂解液
在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。 蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选 择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向 电泳分离效果的一个有力措施。
⑴ 离液剂
尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键 等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为 一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/L。尿素 可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使 所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步 提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强 度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后 研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容 物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞， 臵 于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这 会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策 略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白 酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行 样品制备。另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0 的时候会失活，因此在样品裂解液中出现Tris、 碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降 解。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些 蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。 此时，需要应用蛋白酶抑制剂。
⑶
丙酮沉淀
这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许 多杂质，如去污剂、脂类。 于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮，使蛋白 在-20℃沉淀至少2h，再离心沉淀蛋白。残留的 丙酮通过空气干燥或冻干除去。
⑷ 在丙酮中用TCA沉淀
两者联合应用更加有效，通常用10％TCA 在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.01％ β巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT）。至少在20℃沉淀45min，通过离心沉淀蛋白，并用含 0.01％β-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT 的冰 丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残 留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。
亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含 DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和 半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽 （aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素 (bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价 格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图 谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。
⑴ 硫酸铵沉淀 （盐析） 原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉
淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。 步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L, 并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min， 通过离心沉淀蛋白。 然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方 法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵 会干扰IEF,必须被清除。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例 如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物， 或者用于分析某一特定的细胞器，例如只 需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它 的细胞器。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品处理应在冰浴中进行。
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、 霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液臵于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
四、分离和提取蛋白质（蛋白质沉淀步骤）
这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除 杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结 果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后 并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉 淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。