接种猪瘟兔化弱毒株的永生化猪血管内皮细胞传代情况研究
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瘟兔化 弱毒 株后 细胞 的变 化 与 传 代 情 况 ， 猪 瘟 兔 为 化弱毒 疫苗 寻找 新 的培养 基质 。
２ ℃ 备 用 ］ Ｏ 。
固定后 的 细胞单 层 与 Ｆ ＴＣ标 记 的抗 Ｃ Ｆ 的 Ｉ Ｓ Ｖ
多克 隆抗 体 ，７℃ 温育 １ｈ ０ ０ ｌＬ ｐ ． ３ ， ． １ｍｏ／ Ｈ７ ２的
动物 医学进 展 ， ０ ０ ３ （ ） １一 ５ ２ １ ，１ ７ ： ｌ１
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
接种 猪 瘟 兔化 弱 毒 株 的永 生化 猪 血 管 内皮 细胞 传 代 情 况 研 究
谭 晓妮 ， 张彦 明 ， 张 旭 ， 邓 力
表 明 ， 种猪 瘟兔化 弱毒 后 ２ 接 Ｏ代 （ ９ 第 Ｏ代 永 生化猪 血 管 内皮 细胞 ） 细胞 与 正 常的形 态相 似 ， 传 至接 毒后 的 但
３ ５代 （ １ ５代 永 生化 猪 血 管 内皮 细胞 ） ， 第 ０ 时 细胞 稍 有 拉 长 现 象 。各代 次 细胞 中都 有猪 瘟 兔 化 弱毒 的检 出。
生产疫 苗 时 ， 传代 细胞 的 ， 量 不 用原 代 细胞 。因 有 尽
１ ２ １ 永 生化 猪血 管 内皮 细胞 的培 养 、 毒 及 连 续 ． ． 接
传代 条 件 用 ＤＭＥ （ 糖 ） 养 液 加 １ ０ ｍＬ Ｌ Ｍ 高 培 ０ ／ 无 牛病 毒性腹 泻病 毒抗 体 的胎 牛血 清 作 为永 生化 猪 血 管 内皮细胞 的培 养 液 （ｐ ７ ２ 。待 细 胞 铺 长 成 Ｈ ． ）
６ ～８ 单层 时 接毒 ，７℃感染 １ｈ后 ， Ｏ Ｏ ３ 吸取 多余 毒液 ， Ｄ Ｈａ ｋ 经 － ｎ ｓ洗 涤 ， 维 持 液 （ Ｈ ． ～ ７ ８ 加 ｐ ７６ ．）
培养 ， 持液含 ２ ／ 维 ０ｍＬ Ｌ的胎 牛血 清 。 １ ２ ２ 免疫 荧光检 测 方 法 ．． 将 细胞 培 养 在盖 片 上 ， 在接 毒后 不 同时间 ， ０ ０ Ｉ Ｈ ． 用 ． Ｉｍｏ／Ｌ ｐ ７ ２的 Ｐ Ｓ Ｂ 缓 冲 液 （ ８ ５ｇ Ｌ的 Ｎａ １ 冲 洗 。放 入 纯 丙 酮 中 含 ． ／ Ｃ ） 固定 １ ｉ ， ５ｒ ｎ 自然干 燥后 用 于 免疫 荧 光 检 测 或 存 于 ａ
Ｐ Ｓ缓 冲液 冲洗后 ， 油封 片 。或 与 Ｃ Ｆ 的 单 克 Ｂ 甘 Ｓ Ｖ
隆 抗 体温育 ， Ｓ 封闭后 ， Ｆ Ｔ ＢＡ 经 Ｉ Ｃ标 记 的抗 鼠抗体
（ ｉｍａ 司）温 育 、 片 。用 Ｎｉｏ Ｓｇ 公 封 ｋ ｎ荧 光 显微 镜 于 波 长为 ４ ５ｎ 激发 光下 观察 。 ９ ｍ ］ １ ２ ３ 流式 细 胞 仪 样 品制 备 根 据 细 胞 试 验 条 件 ． ．
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 细胞 与 毒 株 永 生 化 猪 血 管 内皮 细 胞 系 ． ． （ ＵＶ Ｃ 由西 北 农 林 科 技 大 学 动 物 医 学 院 张 彦 明 Ｓ Ｅ ）
（ 北 农 林 科 技 大 学 动 物 医学 院 ， 西 杨 陵 ７ ２０ ） 西 陕 １ １ ０
摘 要 ： 传 至 ７ 在 Ｏ代 的永 生化猪 血 管 内皮 细胞接 种猪 瘟 兔化 弱 毒 ， ２ｈ后 收取 细 胞上 清 液 并对 处 理 的 ７
细胞进行 传代 培养 ， 别检 测 第 ７ 、５ ８ 、 ０ １ ０ １ ５代 接毒 细胞 中病 毒 ， 分 Ｏ ７ 、 Ｏ ９ 、０ 、 ０ 观察 各代 细胞 的生 长情 况 。结果
微镜 ； 凝胶 成像 系统 ； ｉ—ａ Ｃ ＢｏｒｄＰ Ｒ仪 。
触性传 染病 ， 特 征 是 小血 管 的 变化 所 导 致 的 内脏 其
器官 中的多发 性 出血 、 坏死 Ｌ ， １ 给养 猪 业 造成 了 巨 大 ］ 经济损 失 。我 国从 ２ 世 纪 ６ Ｏ Ｏ年代 开 始采 用猪 瘟 兔 化 弱毒 疫苗预 防接 种 来 防 控 猪 瘟 ， 得 了显 著 的成 取 效 。在 异源 原代 细胞 中增殖 的猪 瘟 兔化 弱毒疫 苗 株 （ Ｌ 是 我 国 主 要 的 弱 毒 疫 苗 Ｌ 。但 近 年 来 普 ＨＣ Ｖ） ２ ］ 遍 反映 牛睾丸 原代 细胞 生产 的猪 瘟 兔化 弱 毒疫 苗 的 毒 价不稳 定 ，Baidu Nhomakorabea病 毒 滴 度 较 低 ， 疫 效果 不 确 实 ， 且 免 给 猪 瘟计划 免疫 接 种 带 来 了 困难 。此外 ， 国际 上 提 倡
猪瘟 （ ｌｓｉ ｌ ｗｉｅｆｖ ｒＣ Ｆ 是 由猪瘟 病毒 Ｃ ａ ｓ ａ ｎ ｅ ， Ｓ ） ｃ ｓ ｅ
１ １ ２ 主要仪 器设 备 ．．
１ ２ 方 法 ．
Ｃ ２培养 箱 ； ｋ ｎ荧 光显 ０ Ｎｉｏ
（ ｌ ｓ ａ ｗｉｅｆｖ ｒｖｒ ｓ ｃ Ｆ 引 起 的高 度 接 Ｃ ａ ｉ ｌｓ ｎ ｅ ｅ ｉ ， Ｓ Ｖ） ｓｃ ｕ
本研 究为 永 生化猪 血 管 内皮 细胞 生产 猪瘟 兔化 弱毒 疫 苗奠 定 了基 础 。 关键 词 ： 瘟 兔化弱 毒株 （ Ｌ ； 生化 猪血 管 内皮 细胞 ； 态 变化 ； 猪 ＨＣ Ｖ） 永 形 细胞传 代
中 国 分 类 号 ：８ ２ ６ １ Ｑ １ ． ￥５．５ ； ８３ １ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ７５ ３ （ ０ ０ ０ —０ ｉ０ １ ０ — ０ ８ ２ １ ） ７０ １ － ５
一
此， 能否 找到 比牛 睾 丸 原 代 细 胞 更好 的 生产 猪 瘟 兔 化弱 毒疫 苗的传 代 细胞 ， 成 为 猪瘟 兔 化 弱 毒 疫 苗 已 作 为全 国强制 性 免 疫 用 疫 苗 的 急 需 。鉴 于此 ， 展 开 了用 我们建 立 的永 生化猪 血 管 内皮 细胞 增殖 Ｃ株 病 毒 的的研究 ， 以了 解 永 生化 猪 血 管 内皮 细 胞 接 种猪
２ ℃ 备 用 ］ Ｏ 。
固定后 的 细胞单 层 与 Ｆ ＴＣ标 记 的抗 Ｃ Ｆ 的 Ｉ Ｓ Ｖ
多克 隆抗 体 ，７℃ 温育 １ｈ ０ ０ ｌＬ ｐ ． ３ ， ． １ｍｏ／ Ｈ７ ２的
动物 医学进 展 ， ０ ０ ３ （ ） １一 ５ ２ １ ，１ ７ ： ｌ１
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
接种 猪 瘟 兔化 弱 毒 株 的永 生化 猪 血 管 内皮 细胞 传 代 情 况 研 究
谭 晓妮 ， 张彦 明 ， 张 旭 ， 邓 力
表 明 ， 种猪 瘟兔化 弱毒 后 ２ 接 Ｏ代 （ ９ 第 Ｏ代 永 生化猪 血 管 内皮 细胞 ） 细胞 与 正 常的形 态相 似 ， 传 至接 毒后 的 但
３ ５代 （ １ ５代 永 生化 猪 血 管 内皮 细胞 ） ， 第 ０ 时 细胞 稍 有 拉 长 现 象 。各代 次 细胞 中都 有猪 瘟 兔 化 弱毒 的检 出。
生产疫 苗 时 ， 传代 细胞 的 ， 量 不 用原 代 细胞 。因 有 尽
１ ２ １ 永 生化 猪血 管 内皮 细胞 的培 养 、 毒 及 连 续 ． ． 接
传代 条 件 用 ＤＭＥ （ 糖 ） 养 液 加 １ ０ ｍＬ Ｌ Ｍ 高 培 ０ ／ 无 牛病 毒性腹 泻病 毒抗 体 的胎 牛血 清 作 为永 生化 猪 血 管 内皮细胞 的培 养 液 （ｐ ７ ２ 。待 细 胞 铺 长 成 Ｈ ． ）
６ ～８ 单层 时 接毒 ，７℃感染 １ｈ后 ， Ｏ Ｏ ３ 吸取 多余 毒液 ， Ｄ Ｈａ ｋ 经 － ｎ ｓ洗 涤 ， 维 持 液 （ Ｈ ． ～ ７ ８ 加 ｐ ７６ ．）
培养 ， 持液含 ２ ／ 维 ０ｍＬ Ｌ的胎 牛血 清 。 １ ２ ２ 免疫 荧光检 测 方 法 ．． 将 细胞 培 养 在盖 片 上 ， 在接 毒后 不 同时间 ， ０ ０ Ｉ Ｈ ． 用 ． Ｉｍｏ／Ｌ ｐ ７ ２的 Ｐ Ｓ Ｂ 缓 冲 液 （ ８ ５ｇ Ｌ的 Ｎａ １ 冲 洗 。放 入 纯 丙 酮 中 含 ． ／ Ｃ ） 固定 １ ｉ ， ５ｒ ｎ 自然干 燥后 用 于 免疫 荧 光 检 测 或 存 于 ａ
Ｐ Ｓ缓 冲液 冲洗后 ， 油封 片 。或 与 Ｃ Ｆ 的 单 克 Ｂ 甘 Ｓ Ｖ
隆 抗 体温育 ， Ｓ 封闭后 ， Ｆ Ｔ ＢＡ 经 Ｉ Ｃ标 记 的抗 鼠抗体
（ ｉｍａ 司）温 育 、 片 。用 Ｎｉｏ Ｓｇ 公 封 ｋ ｎ荧 光 显微 镜 于 波 长为 ４ ５ｎ 激发 光下 观察 。 ９ ｍ ］ １ ２ ３ 流式 细 胞 仪 样 品制 备 根 据 细 胞 试 验 条 件 ． ．
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 细胞 与 毒 株 永 生 化 猪 血 管 内皮 细 胞 系 ． ． （ ＵＶ Ｃ 由西 北 农 林 科 技 大 学 动 物 医 学 院 张 彦 明 Ｓ Ｅ ）
（ 北 农 林 科 技 大 学 动 物 医学 院 ， 西 杨 陵 ７ ２０ ） 西 陕 １ １ ０
摘 要 ： 传 至 ７ 在 Ｏ代 的永 生化猪 血 管 内皮 细胞接 种猪 瘟 兔化 弱 毒 ， ２ｈ后 收取 细 胞上 清 液 并对 处 理 的 ７
细胞进行 传代 培养 ， 别检 测 第 ７ 、５ ８ 、 ０ １ ０ １ ５代 接毒 细胞 中病 毒 ， 分 Ｏ ７ 、 Ｏ ９ 、０ 、 ０ 观察 各代 细胞 的生 长情 况 。结果
微镜 ； 凝胶 成像 系统 ； ｉ—ａ Ｃ ＢｏｒｄＰ Ｒ仪 。
触性传 染病 ， 特 征 是 小血 管 的 变化 所 导 致 的 内脏 其
器官 中的多发 性 出血 、 坏死 Ｌ ， １ 给养 猪 业 造成 了 巨 大 ］ 经济损 失 。我 国从 ２ 世 纪 ６ Ｏ Ｏ年代 开 始采 用猪 瘟 兔 化 弱毒 疫苗预 防接 种 来 防 控 猪 瘟 ， 得 了显 著 的成 取 效 。在 异源 原代 细胞 中增殖 的猪 瘟 兔化 弱毒疫 苗 株 （ Ｌ 是 我 国 主 要 的 弱 毒 疫 苗 Ｌ 。但 近 年 来 普 ＨＣ Ｖ） ２ ］ 遍 反映 牛睾丸 原代 细胞 生产 的猪 瘟 兔化 弱 毒疫 苗 的 毒 价不稳 定 ，Baidu Nhomakorabea病 毒 滴 度 较 低 ， 疫 效果 不 确 实 ， 且 免 给 猪 瘟计划 免疫 接 种 带 来 了 困难 。此外 ， 国际 上 提 倡
猪瘟 （ ｌｓｉ ｌ ｗｉｅｆｖ ｒＣ Ｆ 是 由猪瘟 病毒 Ｃ ａ ｓ ａ ｎ ｅ ， Ｓ ） ｃ ｓ ｅ
１ １ ２ 主要仪 器设 备 ．．
１ ２ 方 法 ．
Ｃ ２培养 箱 ； ｋ ｎ荧 光显 ０ Ｎｉｏ
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本研 究为 永 生化猪 血 管 内皮 细胞 生产 猪瘟 兔化 弱毒 疫 苗奠 定 了基 础 。 关键 词 ： 瘟 兔化弱 毒株 （ Ｌ ； 生化 猪血 管 内皮 细胞 ； 态 变化 ； 猪 ＨＣ Ｖ） 永 形 细胞传 代
中 国 分 类 号 ：８ ２ ６ １ Ｑ １ ． ￥５．５ ； ８３ １ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ７５ ３ （ ０ ０ ０ —０ ｉ０ １ ０ — ０ ８ ２ １ ） ７０ １ － ５
一
此， 能否 找到 比牛 睾 丸 原 代 细 胞 更好 的 生产 猪 瘟 兔 化弱 毒疫 苗的传 代 细胞 ， 成 为 猪瘟 兔 化 弱 毒 疫 苗 已 作 为全 国强制 性 免 疫 用 疫 苗 的 急 需 。鉴 于此 ， 展 开 了用 我们建 立 的永 生化猪 血 管 内皮 细胞 增殖 Ｃ株 病 毒 的的研究 ， 以了 解 永 生化 猪 血 管 内皮 细 胞 接 种猪